【摘要】：目的:探討伊曲康唑(Itraconazole,ITZ)對(duì)巨噬細(xì)胞的極化及其吞噬白念珠菌(Candida albicans,C.albicans)能力的影響。方法:采用小鼠類(lèi)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系,實(shí)驗(yàn)組:0.25、0.5、1μM伊曲康唑和脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)或紫外滅活C.albicans處理;對(duì)照組:加LPS、IL-4或C.albicans,不加伊曲康唑處理;陰性對(duì)照組:不加任何刺激,不加伊曲康唑處理。(1)不加伊曲康唑組作對(duì)照,用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell counting kit-8,CCK-8)檢測(cè)0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16μM伊曲康唑在12、24、48 h時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響;(2)紫外滅活C.albicans;(2)異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)染C.albicans,RAW264.7細(xì)胞:C.albicans比例為1:4和1:8時(shí),流式細(xì)胞儀(Flow cytometry,FCM)定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組巨噬細(xì)胞吞噬白念珠菌能力的差異;(3)紅色熒光細(xì)胞鏈接試劑盒(PKH 26)染RAW264.7細(xì)胞膜,FITC染C.albicans,共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscope,CLSM)定性檢測(cè)伊曲康唑?qū)AW264.7細(xì)胞吞噬紫外滅活的酵母相C.albicans的影響;(4)流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)(Cytometric beads array,CBA)或液相芯片分析技術(shù)(Luminex)檢測(cè)LPS、IL-4和紫外滅活C.albicans誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞在不同濃度伊曲康唑作用下細(xì)胞因子的分泌;(5)免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)LPS、IL-4和紫外滅活C.albicans誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞在不同濃度伊曲康唑作用下誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)和精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)的表達(dá)。結(jié)果:(1)與對(duì)照組相比,伊曲康唑?qū)奘杉?xì)胞的毒性具有濃度和時(shí)間依賴(lài):在伊曲康唑濃度1μM作用12 h時(shí),對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性;而在濃度2μM12 h顯示出約14.57±6.96%的抑制作用和1μM 24 h顯示出53.61±1.19%的抑制,在1μM處理48 h和2μM處理48 h后,抑制效果達(dá)90%以上,故0.25、0.5、1μM,12 h被選為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件;(2)FCM定量檢測(cè)0.5和1μM伊曲康唑均顯著增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞吞噬白念珠菌(P0.05);(3)CLSM觀察發(fā)現(xiàn)伊曲康唑顯著增強(qiáng)了RAW264.7細(xì)胞吞噬酵母相C.albicans的能力;(4)伊曲康唑增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌。(5)在IL-4誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中,伊曲康唑提高了IL-6、TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的分泌,同時(shí)降低了白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的分泌。(6)伊曲康唑增強(qiáng)了白念珠菌刺激RAW264.7細(xì)胞IL-6和TNF-α的分泌,而抑制了IL-4和IL-10的分泌。(7)Western blot結(jié)果顯示,在三種不同刺激下,伊曲康唑均增強(qiáng)了i NOS的表達(dá),并適度抑制Arg-1表達(dá)。結(jié)論:高濃度伊曲康唑(≥2μM)對(duì)巨噬細(xì)胞具有毒性效應(yīng);伊曲康唑可促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬;促進(jìn)LPS、IL-4、C.albicans誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞促炎癥因子如IL-6、TNF-α的分泌,抑制IL-4、IL-10的分泌,促使巨噬細(xì)胞向經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(Classically activated macrophage,M1)型的轉(zhuǎn)化。伊曲康唑不僅有抗念珠菌作用,還有免疫激活效能,能夠通過(guò)抑菌與免疫激活的雙重作用促進(jìn)真菌的清除。伊曲康唑提高RAW264.7的M1極化并增強(qiáng)了其吞噬作用,顯示了其在臨床新的應(yīng)用潛力。
【圖文】：

圖 1A. RAW264.7 細(xì)胞鏡下呈圓形，貼壁生長(zhǎng)（200×）圖 1B.流式細(xì)胞儀檢測(cè) F4/80+細(xì)胞高于 95%2 伊曲康唑?qū)?RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用呈劑量和時(shí)間依賴(lài)如圖 2 所示，伊曲康唑?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)。在伊

圖 1A. RAW264.7 細(xì)胞鏡下呈圓形，貼壁生長(zhǎng)（200×）圖 1B.流式細(xì)胞儀檢測(cè) F4/80+細(xì)胞高于 95%2 伊曲康唑?qū)?RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用呈劑量和時(shí)間依賴(lài)如圖 2 所示，，伊曲康唑?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)。在伊
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2614480