【摘要】：硫酸軟骨素(Chondroitin,CS)是一種由D-葡萄糖醛酸殘基(GlacA)及N-乙酰半乳糖胺(GalNac)殘基線性交替組成的糖胺聚糖,在動物的軟骨組織中大量存在。由于具有較好的生物相容性及生物可降解性,這種帶負電荷的糖胺聚糖常與其他藥物偶聯(lián)成為聚合物-藥物結(jié)合物,偶聯(lián)后的結(jié)合物可以增強藥物的生物活性及穩(wěn)定性,降低其細胞毒性,延長在體內(nèi)的半衰期。另外,硫酸軟骨素也是CD44受體的配體,藥物與硫酸軟骨素相連形成結(jié)合物后,具有潛在的主動靶向CD44受體的能力。內(nèi)皮抑素(Endostatin,ES)是一種內(nèi)源性的多肽,分子量為20kDa,具有抗新生血管生成活性,來源于鼠血管內(nèi)皮細胞瘤。ES發(fā)揮抗腫瘤作用的機制是抑制腫瘤組織附近新生血管的生成,從而切斷腫瘤的營養(yǎng)供給途徑及代謝途徑。ES2(IVRRADRAAVP)是ES中的一段短肽,體內(nèi)抗新生血管生成活性約為ES的三倍。Anti-Fltl(AF)是一種來源于合成肽組合文庫中的多肽,這種多肽可以與VEGF-R1相結(jié)合從而特異性抑制VEGF-R1與其配體相結(jié)合。通過多肽固相合成技術(shù),我們將多肽ES2與多肽AF借助連接鏈(GGGG)相連并合成了一種新型的抗新生血管生成肽ES2-AF。然而多肽ES2-AF的生物活性受其血漿半衰期較短的因素限制,頻繁給藥降低了患者的順從性并增加了治療費用。本研究使用化學修飾的方法將硫酸軟骨素與ES2-AF多肽相連,增加了多肽的穩(wěn)定性及靶向CD44受體的作用。本文主要研究內(nèi)容如下:1.ES2-AF及CS-ES2-AF的合稱及表征通過固相合成的方法合成新型的多肽ES2-linker(GGGG)-AF,采用制備液相進行純化,多肽純度約為95.14%。質(zhì)譜結(jié)果顯示分子量與理論值相同。為增加CS在有機溶劑中的溶解度,采用離子交換法制備硫酸軟骨素的四丁基氫氧化銨鹽(CS-TBA)。在隨后的制備反應(yīng)過程中,借助卡特縮合試劑(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophophate castros reagent,BOP)及試劑 N,N-二異丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine,DIPEA)的活化作用使CS-TBA與ES2-AF發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)制備CS-ES2-AF。并以一維核磁共振氫譜(1H nuclear resonance spectroscopy,1H-NMR)方式對CS-ES2-AF進行結(jié)構(gòu)確證。通過1H-NMR數(shù)據(jù)的曲線下面積積分結(jié)果,確定每條CS鏈上平均連接2個ES2-AF多肽。2.ES2-AF及CS-ES2-AF的體內(nèi)外活性研究(1)使用MTT法研究ES2-AF及CS-ES2-AF在體外對血管內(nèi)皮細胞的抑制作用。兩種藥物對內(nèi)皮細胞的抑制作用均呈濃度依賴性,當ES2-AF的濃度達到200 μg/mL時,CS-ES2-AF表現(xiàn)出明顯優(yōu)于ES2-AF的抑制作用。(2)采用劃痕法研究CS-ES2-AF及ES2-AF對內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用。實驗結(jié)果顯示ES2-AF、CS與ES2-AF的物理混合物及CS-ES2-AF均可抑制內(nèi)皮細胞的遷移運動,當ES2-AF濃度為50～200μg/mL時,結(jié)合物CS-ES2-AF的活性明顯優(yōu)于其他兩個實驗組。另外,所有實驗組的抑制作用均呈濃度依賴性。(3)通過體外管腔形成抑制實驗評價ES2-AF、CSES2-AF、CS-ES2-AF抑制內(nèi)皮細胞形成管腔的能力。當ES2-AF的濃度相同時,結(jié)合物CS-ES2-AF抑制內(nèi)皮細胞形成管腔的作用較未經(jīng)修飾的多肽ES2-AF顯著提高。(4)借助雞胚絨毛膜尿囊膜實驗法(Chick chorioallantoic membrane,CAM)研究ES2-AF及CS-ES2-AF在生物體內(nèi)抑制新生血管生成的活性。實驗結(jié)果顯示,當 ES2-AF 濃度為 10 μg/mL 及 25 μg/mL 時,CS-ES2-AF 的活性與 ES2-AF無明顯差異,;當ES2-AF濃度達到50μg/mL時,結(jié)合物CS-ES2-AF的活性才明顯的強于ES2-AF。3.CS-ES2-AF的靶向性研究(1)使用酶聯(lián)免疫法吸附測定法(ELISA法)評價藥物抑制VEGF與其受體VEGF-R1結(jié)合的能力。所有實驗組均有抑制VEGF與VEGF-R1受體結(jié)合的能力,且呈濃度依賴性。與ES2-AF組相比,相同濃度的CSES2-AF及CS-ES2-AF抑制VEGF與其受體結(jié)合的能力明顯增強,且CS-ES2-AF與ES2-AF的組間差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。(2)采用表面等離子共振技術(shù)(Surface plasmon resonance,SPR)研究ES2-AF與CS-ES2-AF靶向CD44受體的能力。首先篩選了適宜的pH值使CD44蛋白連在CM5芯片上,當pH值為3.8時,CD44蛋白連接于芯片上產(chǎn)生的響應(yīng)值最大,在此條件下進行偶聯(lián)反應(yīng),蛋白最終偶聯(lián)量為394.8RU。分別將不同濃度的樣品溶液流經(jīng)CM5芯片進行并對分析物與CD44蛋白之間的親和力進行檢測,測得CS-ES2-AF及ES2-AF的平衡解離常數(shù)(KD)分別為9.895×10-9及3.01 1×10-4。實驗數(shù)據(jù)表明結(jié)合物CS-ES2-AF增強了原有多肽靶向CD44受體的能力。(3)通過小動物實時活體成像技術(shù)可動態(tài)觀察具有熒光標記的ES2-AF-FITC及CS-ES2-AF-FITC在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布情況。首先使用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標記 ES2-AF 及 CS-ES2-AF,并采用尾靜脈注射給藥的方式對荷瘤裸鼠進行給藥,并通過小動物活體成像儀進行觀察。相比于ES2-AF,CS-ES2-AF表現(xiàn)出較長的半衰期及一定的腫瘤靶向性。4.ES2-AF及CS-ES2-AF的藥代動力學研究通過熒光酶標儀以熒光分光光度法測定ES2-AF及CS-ES2-AF的濃度,該方法符合生物樣本測定方法學的要求。以腹腔注射方式分別給balb/c小鼠注射20mg/kg的藥物。通過對ES2-AF及CS-ES2-AF的藥代動力學參數(shù)進行分析,CS-ES2-AF組在小鼠體內(nèi)的循環(huán)時間明顯延長,意味著CS-ES2-AF在小鼠血漿內(nèi)的穩(wěn)定性優(yōu)于ES2-AF。在本研究中,成功制備了硫酸軟骨素化的抑制新生血管生成肽結(jié)合物CS-ES2-AF,并以1H-NMR方式進行結(jié)構(gòu)表征。通過一系列生物活性實驗,結(jié)合物CS-ES2-AF表現(xiàn)出顯著的生物活性,且具有主動靶向性及較長的血漿半衰期。采用硫酸軟骨素修飾ES2-AF可顯著增強其抗新生血管生成活性并減少給藥次數(shù),這在未來的臨床應(yīng)用中有良好的潛力。
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圖１－１邋ＣＳ－ＴＢＡ的合成路線逡逑Ｆｉｕｒｅ邋１－１邋Ｓｎｔｈｅｔｉｃ邋ｒｏｕｔｅ邋ｏｆ邋ＣＳ－ＴＢＡ逡逑

逡逑圖１－２邋ＣＳ－ＥＳ２－ＡＦ的合成路線逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｒｏｕｔｅ邋ｏｆ邋ＣＳ－ＥＳ２－ＡＦ逡逑７．ＣＳ－ＥＳ２－ＡＦ樣品的核磁共振一維氧譜ＯＨ－ＮＭＲ）分析逡逑�。茫樱牛樱玻粒乒腆w樣品３．０ｍｇ左右溶于０．５ｍＬ重水Ｄ２０中，在千燥環(huán)境下逡逑迅速轉(zhuǎn)移至核磁管中。通過核磁共振波譜儀采集并記錄＾－ＮＭＲ譜圖，與ＣＳ－ＴＢＡ逡逑樣品的圖譜進行對比，，分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。逡逑三、實驗結(jié)果逡逑１．邋ＥＳ２－ＡＦ肽經(jīng)固相合成后的表征逡逑將經(jīng)固相合成的多肽ＥＳ２－ＡＦ經(jīng)高效液相色譜法進行分析，采用面積歸一化逡逑法計算反應(yīng)制得多肽ＥＳ２－ＡＦ純度。具體組成分析如表１－１所示，液相色譜分離逡逑結(jié)果如圖１－３所示，測得多肽ＥＳ２－ＡＦ的純度為９５．４１°／。，保留時間為７．７５０ｍｉｎ。逡逑邐％￣￣逡逑ｔ逡逑－邐ｊ逡逑丨|義希

本文編號：2612775