【摘要】：背景:趨化因子CXCL9(C-X-C motif chemokine 9)是缺乏ELR結構域的CXC趨化因子亞族之一,可趨化T淋巴細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞,在白細胞運輸中起關鍵作用,作用于活化的CD4~+Th1細胞,CD8~+T細胞,IL-2活化的T淋巴細胞和NK細胞等。CXCL9在許多疾病中發(fā)揮重要作用,包括外部感染、腫瘤治療、自體免疫性疾病、移植排斥反應等,最近報道CXCL9在腫瘤化療中具有保護造血干細胞的作用。然而,CXCL9在大腸桿菌系統(tǒng)中表達易形成包涵體,通過變性復性過程獲得,不僅增加純化步驟,增大生產(chǎn)過程中的經(jīng)濟及時間成本,并且變性過程存在疏水區(qū)過度暴露的風險,蛋白空間結構改變可能導致最終產(chǎn)物的生物學活性較差。因此,可溶表達對提高大腸桿菌生產(chǎn)CXCL9的規(guī)�；a(chǎn)具有關鍵意義。本研究中,我們探討內(nèi)含肽介導的CXCL9重組蛋白可溶性表達純化系統(tǒng)建立及應用,對原有制備工藝進行優(yōu)化,實現(xiàn)CXCL9的可溶性表達及高效純化。方法:本研究中,我們借助低溫誘導和內(nèi)含肽系統(tǒng)實現(xiàn)CXCL9在大腸桿菌內(nèi)的可溶性表達。采用具有C端自剪切功能的內(nèi)含肽?I-CM,本課題構建了3種“標簽+?I-CM+CXCL9”組合,以蛋白可溶性為主要判斷標準,篩選最優(yōu)組合。進一步優(yōu)化溫度表達條件后,選擇Zbasic-?I-CM-CXCL937°C融合表達和25°C條件下低溫誘導表達的產(chǎn)物進行純化。我們根據(jù)目的蛋白的相關性質(zhì)進行了一系列純化方案探索,最終確定了“SP FF(陽離子交換色譜)→CHT I(陶瓷羥基磷灰石柱色譜)”的兩步純化策略。采用該策略,將可溶表達的CXCL9從細菌裂解上清中純化出來:陽離子交換色譜作為第一步粗純方法,用SP FF強陽離子交換介質(zhì)純化并濃縮。得到的洗脫產(chǎn)物超濾脫鹽,第二步用CHT I精純得到最終產(chǎn)品。為了與Zbasic-?I-CM促溶系統(tǒng)和低溫誘導促溶對比,我們參照文獻報道重復了包涵體的變復性工藝,37°C誘導得到的菌體裂菌后收集沉淀,用8 M尿素溶解后于pH 6.0稀釋復性,再調(diào)節(jié)pH至7.2后上樣,采用SP FF一步純化得最終產(chǎn)品。結果:通過比較FATT、Fh8和Zbasic三個促溶標簽,Zbasic-?I-CM-CXCL9融合表達策略在37°C下能夠得到較優(yōu)的可溶效率和較高的表達量。優(yōu)化可溶表達條件后,發(fā)現(xiàn)25°C條件下低溫誘導表達可以達到較好的單獨CXCL9可溶性表達的最優(yōu)產(chǎn)量。因此,我們分別采用Zbasic-?I-CM可溶表達系統(tǒng)、低溫誘導表達系統(tǒng)、包涵體變復性表達系統(tǒng)進行CXCL9的純化研究,并考察其效率。為了評價三種方法所得CXCL9產(chǎn)品的質(zhì)量特征,我們建立了一系列包括考馬斯亮藍(SDS-PAGE)電泳分析,分子篩排阻色譜(SEC-HPLC)檢測樣品純度,和超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-MS)質(zhì)譜儀測定蛋白完整分子量的檢測方法。結果顯示純化所得CXCL9產(chǎn)品純度超過97%,結構完整,LC-MS相對分子量符合預測值。我們利用HUVEC細胞增殖實驗檢測終產(chǎn)品的活性,IC_(50)為4.13-8.33μg/mL,表明純化所得的CXCL9均具有一定的生物學活性。Zbasic-?I-CM系統(tǒng)有效實現(xiàn)了CXCL9的高效可溶表達純化,省時節(jié)能成本低廉,為開發(fā)新型的適用于更多細胞因子類藥物生產(chǎn)的表達系統(tǒng)提供參考。
【圖文】：

CL9 簡介構與分類mokines, chemoattractant cytokines）是一類小其分子量為 8-10 kDa，可作為化學誘導物引細胞的遷移。目前已發(fā)現(xiàn)將近 50 種趨化因子 種 G 蛋白偶聯(lián)跨膜受體。研究表明，趨化因作用，如白細胞表面的葡萄糖胺聚糖。白細用力在內(nèi)皮細胞表面發(fā)生滾動運動，從而激信號通路上調(diào)，導致細胞骨架發(fā)生改變產(chǎn)生趨的相互作用，趨化因子可作用于多種生理及炎癥反應，，腫瘤的形成及其轉(zhuǎn)移等[2-4]。

上海交通大學碩士學位論文亞族中，第一個半胱氨酸與第三個半胱氨酸形成二硫鍵，第二個與第四形成二硫鍵。CXC 趨化因子對于嗜中性粒細胞和淋巴細胞具有特征趨化化因子作用于大部分白細胞，但通常對嗜中性粒細胞沒有活性。CXC 族可根據(jù)是否包含 ELR（glutamate leucine arginine）結構域進一步細分為 ELR 結構域的趨化因子如 CXCL1，CXCL8 和 CXCL7 等與血管生成促，而缺乏 ELR 結構域的細胞因子通�？杀� IFN-γ 誘導并產(chǎn)生抑制血管生如 CXCL9，CXCL10 和 CXCL11。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R945

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本文編號：2612609