【摘要】：背景:趨化因子CXCL9(C-X-C motif chemokine 9)是缺乏ELR結(jié)構(gòu)域的CXC趨化因子亞族之一,可趨化T淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞,在白細(xì)胞運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用,作用于活化的CD4~+Th1細(xì)胞,CD8~+T細(xì)胞,IL-2活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等。CXCL9在許多疾病中發(fā)揮重要作用,包括外部感染、腫瘤治療、自體免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)等,最近報(bào)道CXCL9在腫瘤化療中具有保護(hù)造血干細(xì)胞的作用。然而,CXCL9在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)易形成包涵體,通過變性復(fù)性過程獲得,不僅增加純化步驟,增大生產(chǎn)過程中的經(jīng)濟(jì)及時(shí)間成本,并且變性過程存在疏水區(qū)過度暴露的風(fēng)險(xiǎn),蛋白空間結(jié)構(gòu)改變可能導(dǎo)致最終產(chǎn)物的生物學(xué)活性較差。因此,可溶表達(dá)對(duì)提高大腸桿菌生產(chǎn)CXCL9的規(guī)模化生產(chǎn)具有關(guān)鍵意義。本研究中,我們探討內(nèi)含肽介導(dǎo)的CXCL9重組蛋白可溶性表達(dá)純化系統(tǒng)建立及應(yīng)用,對(duì)原有制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)CXCL9的可溶性表達(dá)及高效純化。方法:本研究中,我們借助低溫誘導(dǎo)和內(nèi)含肽系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)CXCL9在大腸桿菌內(nèi)的可溶性表達(dá)。采用具有C端自剪切功能的內(nèi)含肽?I-CM,本課題構(gòu)建了3種“標(biāo)簽+?I-CM+CXCL9”組合,以蛋白可溶性為主要判斷標(biāo)準(zhǔn),篩選最優(yōu)組合。進(jìn)一步優(yōu)化溫度表達(dá)條件后,選擇Zbasic-?I-CM-CXCL937°C融合表達(dá)和25°C條件下低溫誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行純化。我們根據(jù)目的蛋白的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了一系列純化方案探索,最終確定了“SP FF(陽離子交換色譜)→CHT I(陶瓷羥基磷灰石柱色譜)”的兩步純化策略。采用該策略,將可溶表達(dá)的CXCL9從細(xì)菌裂解上清中純化出來:陽離子交換色譜作為第一步粗純方法,用SP FF強(qiáng)陽離子交換介質(zhì)純化并濃縮。得到的洗脫產(chǎn)物超濾脫鹽,第二步用CHT I精純得到最終產(chǎn)品。為了與Zbasic-?I-CM促溶系統(tǒng)和低溫誘導(dǎo)促溶對(duì)比,我們參照文獻(xiàn)報(bào)道重復(fù)了包涵體的變復(fù)性工藝,37°C誘導(dǎo)得到的菌體裂菌后收集沉淀,用8 M尿素溶解后于pH 6.0稀釋復(fù)性,再調(diào)節(jié)pH至7.2后上樣,采用SP FF一步純化得最終產(chǎn)品。結(jié)果:通過比較FATT、Fh8和Zbasic三個(gè)促溶標(biāo)簽,Zbasic-?I-CM-CXCL9融合表達(dá)策略在37°C下能夠得到較優(yōu)的可溶效率和較高的表達(dá)量。優(yōu)化可溶表達(dá)條件后,發(fā)現(xiàn)25°C條件下低溫誘導(dǎo)表達(dá)可以達(dá)到較好的單獨(dú)CXCL9可溶性表達(dá)的最優(yōu)產(chǎn)量。因此,我們分別采用Zbasic-?I-CM可溶表達(dá)系統(tǒng)、低溫誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、包涵體變復(fù)性表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行CXCL9的純化研究,并考察其效率。為了評(píng)價(jià)三種方法所得CXCL9產(chǎn)品的質(zhì)量特征,我們建立了一系列包括考馬斯亮藍(lán)(SDS-PAGE)電泳分析,分子篩排阻色譜(SEC-HPLC)檢測(cè)樣品純度,和超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-MS)質(zhì)譜儀測(cè)定蛋白完整分子量的檢測(cè)方法。結(jié)果顯示純化所得CXCL9產(chǎn)品純度超過97%,結(jié)構(gòu)完整,LC-MS相對(duì)分子量符合預(yù)測(cè)值。我們利用HUVEC細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)終產(chǎn)品的活性,IC_(50)為4.13-8.33μg/mL,表明純化所得的CXCL9均具有一定的生物學(xué)活性。Zbasic-?I-CM系統(tǒng)有效實(shí)現(xiàn)了CXCL9的高效可溶表達(dá)純化,省時(shí)節(jié)能成本低廉,為開發(fā)新型的適用于更多細(xì)胞因子類藥物生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)提供參考。
【圖文】：

CL9 簡(jiǎn)介構(gòu)與分類mokines, chemoattractant cytokines）是一類小其分子量為 8-10 kDa，可作為化學(xué)誘導(dǎo)物引細(xì)胞的遷移。目前已發(fā)現(xiàn)將近 50 種趨化因子 種 G 蛋白偶聯(lián)跨膜受體。研究表明，趨化因作用，如白細(xì)胞表面的葡萄糖胺聚糖。白細(xì)用力在內(nèi)皮細(xì)胞表面發(fā)生滾動(dòng)運(yùn)動(dòng)，從而激信號(hào)通路上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生改變產(chǎn)生趨的相互作用，趨化因子可作用于多種生理及炎癥反應(yīng)，，腫瘤的形成及其轉(zhuǎn)移等[2-4]。

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文亞族中，第一個(gè)半胱氨酸與第三個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵，第二個(gè)與第四形成二硫鍵。CXC 趨化因子對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞具有特征趨化化因子作用于大部分白細(xì)胞，但通常對(duì)嗜中性粒細(xì)胞沒有活性。CXC 族可根據(jù)是否包含 ELR（glutamate leucine arginine）結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步細(xì)分為 ELR 結(jié)構(gòu)域的趨化因子如 CXCL1，CXCL8 和 CXCL7 等與血管生成促，而缺乏 ELR 結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞因子通�？杀� IFN-γ 誘導(dǎo)并產(chǎn)生抑制血管生如 CXCL9，CXCL10 和 CXCL11。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R945

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本文編號(hào)：2612609