發(fā)布時間：2020-04-02 23:20

【摘要】：目的:建立人血清中咖啡因及其三種初級代謝產(chǎn)物濃度測定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS)方法,并應(yīng)用此方法對使用構(gòu)櫞酸咖啡因治療原發(fā)性呼吸暫停早產(chǎn)兒(Apnea of prematurity,AOP)的常規(guī)檢查剩余血樣進行分析。收集咖啡因血藥濃度數(shù)據(jù)、給藥信息、采血時間、病理生理數(shù)據(jù)及CYP1A2基因型,選擇合適的協(xié)變量,應(yīng)用非線性混合效應(yīng)模型法(Nonlinear mixed effects modeling,NONMEM),建立早產(chǎn)兒咖啡因的群體藥代動力學(Population pharmacokinetics,PPK)模型,從而為臨床安全、合理的用藥提供參考。方法:①人血清中咖啡因及其三種初級代謝產(chǎn)物的UHPLC-MS/MS測定方法的建立及驗證。選擇咖啡因-d9作為內(nèi)標,取血清50 μL,置于1.5 mL離心管中,精密加入含咖啡因-d9的甲醇溶液200 μL,旋渦振蕩1 min沉淀蛋白,靜置5 min,于13000 rpm離心10 min,取上清液進行UHPLC-MS/MS分析。標準曲線及質(zhì)量控制(Quality control,QC)的前處理同樣品。色譜柱:Agilent C18柱(2.1 mm×50 mm,2.2 μm);流動相:0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B);流速:0.3 mL/min;梯度洗脫。采用電噴霧離子化(Electrospray ionization,ESI),正離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitoring,MRM)掃描測定。②早產(chǎn)兒咖啡因PPK模型的建立及驗證。收集并測定剩余血樣中咖啡因及其三種初級代謝物的濃度,準確記錄給藥時間、給藥劑量和采血時間,查找相應(yīng)的生理病理等指標。通過NONMEM軟件,根據(jù)交互作用的條件一階評估法(First order conditional estimation with interaction,FOCEI)來擬合藥動學參數(shù)及其變異性,選擇合適的個體間變異及殘差變異模型,用向前增加法、向后遞減法篩選潛在協(xié)變量,采用似然比檢驗(Likelihood ratio test,LRT)各協(xié)變量對模型參數(shù)的影響,建立最終的群體藥代動力學模型并通過圖形結(jié)合統(tǒng)計學方法進行驗證。結(jié)果:①建立的UHPLC-MS/MS法測定咖啡因在200～75000 ng/mL,茶堿在10～25000 ng/mL,1,7-二甲基黃嘌呤在10～10000 ng/mL,可可堿在10～2500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。日內(nèi)、日間精密度RSD均≤7.9%,平均回收率在89.2%～109.4%。該分析方法選擇性良好、靈敏度高�；|(zhì)效應(yīng)、提取回收率、過程效率均符合要求。室溫放置24小時、4℃放置2天、-80℃放置16天內(nèi)均穩(wěn)定,經(jīng)過3次凍融循環(huán)(-80℃)穩(wěn)定。②選擇一級消除的一房室模型結(jié)合個體間變異和殘差變異均用指數(shù)模型是基礎(chǔ)模型的最佳選擇。通過在基礎(chǔ)模型中將先驗的異速生長模型相關(guān)系數(shù)合并在當日體重(Current weight,CW)考慮(CL取0.75,Vd取1),CW導(dǎo)致目標函數(shù)值(Objective function value,OFV)下降117.88(P0.05);矯正胎齡(Postmenstrual age,PMA)使清除率的OFV下降8.49(P0.05),血清肌酐濃度(Serum creatinine concentration,CREA)使清除率的OFV進一步下降5.99(P0.05),通過向后遞減顯示PMA、CREA對OFV均有顯著影響(P0.05),CYP1A2基因型和其它協(xié)變量未導(dǎo)致OFV進一步變化。最終模型關(guān)系式如下:CL(L/h)=θ1×(CW/1280)0.75×(PMA/31.1)θ×1/(CREA/68)84 Vd(L)=θ2×(CW/1280)CL:清除率;Vd:表觀分布容積;CW:當日體重(g);PMA:矯正胎齡(weeks);CREA:血清肌酐濃度(μmol/L);1280 g、31.1 weeks、68 μmol/L分別是研究人群CW、PMA、CREA的中位數(shù)值;θ1、θ2分別是清除率、表觀分布容積的群體典型值;θ3、θ4分別是PMA、CREA的固定效應(yīng)影響因子。結(jié)論:建立了一種快速、靈敏的UHPLC-MS/MS分析方法,經(jīng)驗證適用于早產(chǎn)兒常規(guī)檢查剩余血清中咖啡因及三種代謝產(chǎn)物濃度的測定。通過NONMEM軟件建立的早產(chǎn)兒咖啡因群體藥代動力學模型,最終模型咖啡因清除率(CL)與矯正胎齡(PMA)、當日體重(CW)和血清肌酐濃度(CREA)相關(guān),表觀分布容積(Vd)與當日體重(CW)相關(guān),CYP1A2基因型和其它協(xié)變量對咖啡因的群體藥代動力學參數(shù)均未表現(xiàn)出影響。最終模型經(jīng)圖形結(jié)合統(tǒng)計學方法驗證具有較好的準確性、適用性和穩(wěn)定性,可以為早產(chǎn)兒安全、合理的用藥提供參考。
【圖文】：

圖２．２混合工作液的ＴＩＣ圖（１－可可堿；２－１，，７－二甲基黃嘌呤；３－茶堿；４－咖啡因）逡逑Ｆｉｇ．２．２邋ＴＩＣ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍｉｘｅｄ邋ｗｏｒｋｉｎｇ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋（１－ＴＢ；邋２－１，７－ＤＴＴ；邋３－ＴＨ；邋４－ＣＡ）逡逑

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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R969.1

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