【摘要】：第一部分α-DG糖基化在慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激所致小鼠抑郁樣行為中的作用目的:α-肌營養(yǎng)不良聚糖(α-dystroglycan,α-DG)為抗肌萎縮蛋白相關(guān)復(fù)合體(dystrophin-glycoprotein complex,DGC)的核心組成部分,也為多種細(xì)胞外基質(zhì)分子的高親和力受體。α-DG前體蛋白分子量大小為72 kDa,中間區(qū)域結(jié)構(gòu)含黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域(mucin-like domain),翻譯后主要經(jīng)過糖基化修飾該結(jié)構(gòu)域形成糖基化α-DG(glycosylated α-DG,GLY-α-DG),且在不同組織中α-DG的糖基基團(tuán)所占比例不同,因此蛋白分子量差異較大,在骨骼肌、心肌和腦組織和周圍神經(jīng)中形成蛋白的分子量為156,140和120kDa。α-DG的N端可通過蛋白酶剪切形成分子量大小為39kDa的游離分子,簡稱α-DG-N,可分泌入腦脊液和血漿中�，F(xiàn)有研究表明α-DG的低糖基化狀態(tài)與疾病的發(fā)生密切相關(guān),但主要集中于肌營養(yǎng)不良相關(guān)的疾病中,在抑郁癥中的研究尚未報(bào)道。C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J小鼠(X-連鎖肌萎縮小鼠,mdx小鼠)為常用的研究杜氏肌營養(yǎng)不良的基因敲除鼠模型,盡管該模型鼠直接敲除的是DGC復(fù)合體中表達(dá)的分子肌萎縮蛋白(dystrophin),但大量研究表明其外周和腦組織中GLY-α-DG的表達(dá)顯著下調(diào),且該模型鼠表現(xiàn)出認(rèn)知功能損傷和焦慮水平提高,近年來研究表明抑郁癥患者(major depressive disorder,MDD)認(rèn)知功能也存在缺陷,常伴隨焦慮癥狀。提示可以選用mdx小鼠來研究GLY-α-DG與抑郁癥發(fā)生的關(guān)系。本部分研究主要運(yùn)用慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激(chronic social defeat stress,CSDS)方法建立小鼠抑郁模型,檢測與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)的腦區(qū)中GLY-α-DG的蛋白表達(dá)水平,結(jié)合mdx小鼠行為學(xué)研究,探討GLY-α-DG在CSDS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為中的作用。方法:采用CSDS方法建立小鼠抑郁癥模型;采用western blot方法檢測CSDS敏感鼠和抵抗鼠中α-DG蛋白在抑郁癥相關(guān)腦區(qū)的變化,包括前額葉皮層(prefrontal cortex,PFC),尾殼核(caudate putamen,CPu),伏隔核(nucleus accumbens,NAc),海馬(hippocampus,Hip),韁核(habenular nuclei,Hb),外側(cè)杏仁核(lateral amygdala,LA)和中央杏仁核(central amygdala,CeA);進(jìn)一步細(xì)分海馬為背側(cè)海馬(dorsal hippocampus,dHip)和腹側(cè)海馬(ventral hippocampus,vHip),采用 western blot 方法檢測背側(cè)海馬和腹側(cè)海馬α-DG的蛋白表達(dá)變化;采用免疫熒光方法檢測α-DG在腹側(cè)海馬各個(gè)亞區(qū)的表達(dá)(CA1,CA3和DG);采用western blot方法檢測腹側(cè)海馬糖基化α-DG(GLY-α-DG)的蛋白表達(dá)變化;免疫熒光方法驗(yàn)證mdx小鼠的基因敲除效果,western blot方法檢測mdx小鼠中GLY-α-DG的蛋白表達(dá)水平;檢測mdx小鼠抑郁、焦慮相關(guān)行為學(xué);亞應(yīng)激檢測mdx小鼠對(duì)應(yīng)激的易感性;構(gòu)建α-DG編碼基因DAG1的沉默病毒si-DAG1,驗(yàn)證其沉默效果,然后檢測腹側(cè)海馬腦區(qū)注射si-DAG1對(duì)小鼠應(yīng)激易感性的影響。結(jié)果:(1)經(jīng)過為期十天的CSDS后,行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)CSDS敏感鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為,社會(huì)接觸比值降低(control:1.57±0.17,n = 22;susceptible:0.51 ±0.06,n = 30,p0.01 vs control),糖水偏好率降低(control:0.88 ±0.01,n = 22;susceptible:0.48± 0.03,n = 30,p0.01 vs control);CSDS抵抗小鼠的社會(huì)接觸比值和糖水偏好率分別為1.46±0.07和0.84±0.03(n = 21),同對(duì)照相比無明顯差異。(2)檢測各腦區(qū)α-DG的蛋白表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CSDS敏感鼠中,僅海馬腦區(qū)α-DG的蛋白表達(dá)顯著下降(control:1.00 ± 0.03;susceptible:0.69 ± 0.08,n = 12-13 mice/group,p0.01 vs control),而CSDS抵抗鼠中α-DG的蛋白表達(dá)在各腦區(qū)無明顯差異。(3)細(xì)分海馬為背側(cè)和腹側(cè)亞區(qū),發(fā)現(xiàn)這種降低趨勢主要出現(xiàn)在腹側(cè)海馬(control:0.99 ± 0.02;susceptible:0.79 ± 0.03,n = 11-13 mice/group,p0.05 vs control),背側(cè)海馬則無明顯變化(control:0.90 ±0.03,susceptible:0.99 ±0.03,n = 8-9 mice/group)。進(jìn)一步用免疫熒光方法進(jìn)行檢測,也得出相同的結(jié)論。(4)腹側(cè)海馬中GLY-α-DG表達(dá)也顯著降低(control:1.00 ±0.03;susceptible:0.80 ±0.04,n= 11-12 mice/group,p0.05 vs control)。(5)免疫熒光結(jié)果表明mdx小鼠中dystrophin長鏈分子完全敲除,基因敲除鼠構(gòu)建成功。Mdx 小鼠 GLY-α-DG 表達(dá)降低(WT:1.00 ±0.03;susceptible:0.77±0.04,n = 4mice/group,p0.01vsWT),尼氏染色中尼氏小體數(shù)目減少。(6)Mdx小鼠表現(xiàn)出高水平的焦慮行為,在曠場行為學(xué)檢測中總運(yùn)動(dòng)距離減少(WT:3757.00±231.10 cm,n= 10;mdx:2855.00 ± 196.70 cm,n= 18,p0.05 vsWT),中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間(center distance:481.40 ±62.88 cm;center time:54.01 ±7.08 s,n = 18)均較野生型小鼠(center distance:748.90±95.97 cm;center time:78.86±8.43 s,n= 10,p0.05 vs WT)顯著降低,平均運(yùn)動(dòng)速度低于野生型小鼠(WT:7.88± 0.24 cm/s,n= 10;mdx:7.01 ±0.19 cm/s,n= 18,p0.0lvsWT)。高架十字迷宮行為學(xué)檢測中,mdx小鼠在開放臂停留時(shí)間較野生型小鼠顯著性減少(WT:83.39 ±9.10 s,n= 10;mdx:29.75 ± 5.88 s,n= 18,p0.01 vs WT),在閉合臂中停留時(shí)間顯著增加(WT:175.80 ±10.31 s,n= 10;mdx:227.40 ± 9.94 s,n= 16,p0.01 vs WT),mdx小鼠運(yùn)動(dòng)距離較野生型小鼠增加(WT:971.70 ±73.03 cm,n= 10;mdx:1182.00±61.68 cm,n=16,p0.05vs WT)。(7)Mdx小鼠表現(xiàn)出部分抑郁樣行為,攝食潛伏期延長(WT:166.80 ±34.14 s,n= 10;mdx:336.20 ±41.60 s,n= 19,p0.05vsWT),在 FST(WT:90.78±11.17s,n = 9;mdx:131.60±11.27s,n=19,p0.05 vs WT)和 TST(WT:88.80 ±13.44 s,n= 10;mdx:122.40 ± 6.18 s,n=12,p0.05 vs WT)中不動(dòng)時(shí)間延長,在新事物認(rèn)知功能檢測中認(rèn)知功能降低(discrimination index:WT:0.66 ±0.03,n = 9;mdx:0.52 ±0.02,n= 19,p0.01 vs WT),但不影響糖水偏好和飲水量。經(jīng)過閾下社會(huì)挫敗應(yīng)激后,mdx小鼠應(yīng)激易感性增強(qiáng),表現(xiàn)出社交逃避行為(WT:1.861 ±0.1775,n = 7;mdx:0.91 ±0.27,n = 8,p0.05vs WT),糖水偏好率也顯著降低(WT:0.75±0.04,n = 8;mdx:0.50±0.07,n = 9,p0.05 vs WT)。(8)GLY-α-DG 的沉默病毒 si-DAGl 降低 GLY-α-DG 的表達(dá)(si-GFP:1.01±0.01,n=16;si-DAGl:0.80±0.02,n=16,p0.01vssi-GFP)。(9)正常鼠沉默GLY-α-DG后進(jìn)行閾下社會(huì)挫敗應(yīng)激,其社會(huì)接觸比值降低(si-GFP:1.61± 0.10;si-DAGl:1.18 ± 0.12,n = 31-32 mice/group,p0.01 vs si-GFP),在 FST(si-GFP:41.29 ± 3.81 s;si-DAGl:71.72 ± 5.40 s,n = 31-32 mice/group,p0.01 vs si-GFP)和 TST(si-GFP:131.60±7.24s;si-DAGl:167.40±6.81s,n = 31-32mice/group,p0.01 vssi-GFP)中的不動(dòng)時(shí)間延長,糖水偏好率降低(si-GFP:0.72±0.03;si-DAG1:0.59 ± 0.04,n = 31-33 mice/group,p0.01 vs si-GFP)。結(jié)論:CSDS誘導(dǎo)出小鼠抑郁樣行為,敏感鼠vHip腦區(qū)α-DG、糖基化α-DG(GLY-α-DG)的蛋白表達(dá)水平均降低。Mdx小鼠GLY-α-DG表達(dá)水平降低,焦慮水平升高,表現(xiàn)出部分抑郁樣行為,且應(yīng)激易感性增加。腹側(cè)海馬腦區(qū)給予慢病毒沉默GLY-α-DG增加小鼠的應(yīng)激易感性。第二部分 調(diào)節(jié)α-DG糖基化在慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激所致小鼠抑郁樣行為的作用目的:糖基化修飾后的α-DG(GLY-α-DG)作為細(xì)胞外基質(zhì)的高親和力,可與富含LG結(jié)構(gòu)域(laminin globular domains)的分子結(jié)合相互作用,主要包括基底膜聚糖(perlecan)、聚集蛋白(agrin)、軸突蛋白(neurexin)等,在抑制性神經(jīng)元中neurexin可與突觸后表達(dá)的神經(jīng)連接蛋白(neuroligin)和神經(jīng)外營養(yǎng)蛋白(neurexophilins)相互作用,與α-DG的結(jié)合不具有特異性。關(guān)于perlecan的研究主要集中于外周及腦血管中。近期研究表明agrin可表達(dá)于培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中,且在神經(jīng)元中的含量為星型膠質(zhì)細(xì)胞含量的千倍,表明腦組織中agrin主要來源于神經(jīng)元。以往對(duì)agrin的研究主要集中于培養(yǎng)的神經(jīng)元中,而在腦組織中的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)擬通過正常鼠給藥篩選agrin產(chǎn)生抗抑郁作用的濃度,并研究agrin在CSDS敏感鼠中的作用。乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(like-acetyl-glucosaminyltransferase,Large)為α-DG糖基化主要的酶,本實(shí)驗(yàn)檢測抑郁模型小鼠中Large的表達(dá)變化,并通過腺相關(guān)病毒調(diào)控Large的表達(dá),研究其對(duì)抑郁樣行為的影響。另外,GLY-α-DG參與穩(wěn)態(tài)突觸可塑性的調(diào)節(jié),GLY-α-DG可抑制GABA能神經(jīng)元受體的膜轉(zhuǎn)運(yùn),過表達(dá)LARGE可增強(qiáng)抑制性突觸的強(qiáng)度,增加GABAA受體膜表達(dá)。已有研究表明海馬腦區(qū)GABA能神經(jīng)元的活性降低,抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA合成酶如GAD65、GAD67表達(dá)降低,GABA遞質(zhì)釋放減少,抑制性突觸傳遞受損�；诖�,我們進(jìn)一步通過電生理研究過表達(dá)Large對(duì)CSDS敏感鼠抑制性突觸傳遞的影響,闡明GLY-α-DG介導(dǎo)CSDS所致小鼠抑郁樣行為的機(jī)制。方法:正常小鼠腹側(cè)海馬腦區(qū)置管進(jìn)行劑量篩選,腦區(qū)定位注射給予agrin,分別在給藥1d和3d后進(jìn)行行為學(xué)檢測;CSDS敏感鼠腹側(cè)海馬置管,連續(xù)給予agrin 3d后,分別在給藥結(jié)束后1 d、1 w、2 w檢測抑郁相關(guān)行為學(xué);用共聚焦熒光拍攝、western blot和qPCR方法驗(yàn)證AAV-Large病毒效果;腹側(cè)海馬腦區(qū)注射該病毒后檢測行為學(xué);采用腦片膜片鉗方法記錄腹側(cè)海馬CA1區(qū)微小抑制性突觸后電流(miniature inhibitory postsynaptic current,mIPSC)。結(jié)果:(1)在正常小鼠中,腹側(cè)海馬單次給予agrin后不影響TST的不動(dòng)時(shí)間;連續(xù)給藥3 d后低、中濃度組的agrin均顯著減少TST不動(dòng)時(shí)間,高濃度組則無明顯作用(vehicle:156.70 ± 18.51 s;10 μg/ml:87.06 ± 13.97 s;20 μg/ml:88.83 ± 21.90 s;40μg/ml:112.30±25.34 s,n = 5-7mice/group,p0.05vsvehicle)。(2)在 CSDS 敏感鼠中,腹側(cè)海馬腦區(qū)連續(xù)給予agrin 3 d,在給藥后1 d,TST不動(dòng)時(shí)間顯著降低(CSDS:160.70±9.27s;1d:129.10±13.53s,n = 5-15mice/group,p0.05vsCSDS),在給藥后lw和2 w無明顯差異。在FST檢測中,與給藥前相比,給藥后1d和給藥后1 w 不動(dòng)時(shí)間均顯著降低(CSDS:59.83 ± 7.170 s;1d:36.08 ± 7.70 s;1w:19.00 ±6.95 s,n = 5-15mice/group,p0.05vsCSDS),但在給藥后 2w 無明顯差異。(3)在 CSDS敏感鼠中檢測主要的糖基化酶Large的蛋白水平,其在CSDS敏感鼠中表達(dá)顯著降低(control:1.00 ± 0.02;susceptible:0.85 ± 0.05;n = 10,p 0.05 vs control)。(4)構(gòu)建過表達(dá)Large的腺相關(guān)病毒AAV-Large,可顯著增加Large的蛋白表達(dá)水平(AAV-GFP:1.00 ±0.05,n = 4;AAV-Large:1.72 ±0.12,n = 7,p0.01 vsAAV-GFP)和 α-DG 的糖基化水平(AAV-GFP:1.00 ±0.01,n = 6;AAV-Large:1.12 ±0.05,n =6)。(5)在CSDS敏感鼠腹側(cè)海馬中注射AAV-Large過表達(dá)病毒,其降低TST(control+ AAV-GFP:142.20 ± 8.13 s;control + AAV-Large:155.60 ± 7.43 s;susceptible +AAV-GFP:170.60 ± 6.50 s;susceptible + AAV-Large:141.50 ± 6.46 s)和 TST(control+ AAV-GFP:31.41 ± 6.14 s;control + AAV-Large:36.64 ± 10.22 s;susceptible+AAV-GFP:59.95 ± 6.15 s;susceptible + AAV-Large:34.06 ± 7.27 s)的不動(dòng)時(shí)間,減輕CSDS敏感鼠的社會(huì)逃避行為,表現(xiàn)為社會(huì)接觸比值降低(control+AAV-GFP:1.39± 0.29;control + AAV-Large:1.17 ± 0.15;susceptible +AAV-GFP:0.61 ± 0.06;susceptible+ AAV-Large:1.60 ± 0.50;n = 10-20 mice/group;p 0.05,p0.01 vs control +AAV-GFP,p0.05,p0.01 vs susceptible + AAV-GFP)。AAV-GFP 則無上述效果。(6)腹側(cè)海馬過表達(dá)Large阻斷CSDS敏感鼠mIPSC頻率(control + AAV-GFP:5.01± 0.36 Hz;control +AAV-Large:4.48 ± 0.64 Hz;susceptible +AAV-GFP:3.34 ± 0.37 Hz;susceptible +AAV-Large:5.71 ± 0.37 Hz,n = 5-10 cells from 3-5 mice per group,p0.01 vs control + AAV-GFP,p0.01 vs susceptible + AAV-GFP)和幅度的降低(control +AAV-GFP:11.21 ± 0.29 pA;control + AAV-Large:8.65 ± 0.44 pA;susceptible +AAV-GFP:9.52 ± 0.29 pA;susceptible + AAV-Large:11.24 ± 0.42 pA,n = 5-10 cells from 3-5 mice per group,p0.01 vs control + AAV-GFP,p0.01 vs susceptible + AAV-GFP)。結(jié)論:正常小鼠腹側(cè)海馬腦區(qū)定位給藥3天,低、中濃度agrin減少TST不動(dòng)時(shí)間。抑郁模型鼠給予中濃度agrin 3天后產(chǎn)生抗抑郁作用,部分行為學(xué)改善作用可維持1 w左右,給藥2 w后檢測無抗抑郁作用。應(yīng)激敏感鼠腹側(cè)海馬中Large蛋白表達(dá)水平降低,在該腦區(qū)定位注射過表達(dá)LARGE的AAV病毒,可改善CSDS敏感鼠的抑郁樣行為,同時(shí)拮抗mIPSC頻率和幅度的降低。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.4

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1 姜春玲,洪昭雄;腹側(cè)海馬在癲癇研究中的重要作用[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1998年04期

2 姜春玲,王有偉,張萬琴,洪昭雄;癲癇研究中背腹側(cè)海馬在功能上的差異[J];國外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè));1999年03期

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本文編號(hào)：2612232