【摘要】：目的:(1)構(gòu)建鮑曼不動(dòng)桿菌(AB)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-1605的生物膜模型并測(cè)定其生長曲線及生物膜形成曲線。(2)檢測(cè)抗菌藥物美羅培南、頭孢哌酮鈉、頭孢哌酮/舒巴坦鈉、舒巴坦及抗菌肽IDR-1018對(duì)ATCC BAA-1605菌株的最低抑菌濃度(MIC)。(3)明確IDR-1018聯(lián)合美羅培南或舒巴坦的抗菌作用。(4)探究美羅培南、舒巴坦及IDR-1018對(duì)AB生物膜形成的抑制作用及對(duì)已形成生物膜的破壞作用。方法:(1)構(gòu)建AB生物膜模型并測(cè)定其生長曲線及生物膜形成曲線:96孔板中培養(yǎng)AB,每2h取出200μl,于600nm處測(cè)量吸光度值,得到AB生長曲線;于聚氯乙烯(PVC)材質(zhì)的96孔板中培養(yǎng)AB,每24h取出一組(每組3孔),結(jié)晶紫染色法觀察生物膜,建立AB生物膜模型并得到生物膜形成曲線。(2)微量肉湯稀釋法分別檢測(cè)美羅培南、頭孢哌酮鈉、頭孢哌酮/舒巴坦鈉、舒巴坦及抗菌肽IDR-1018對(duì)ATCC BAA-1605菌株的最低抑菌濃度(MIC)。(3)微量棋盤稀釋法確定IDR-1018聯(lián)合美羅培南或舒巴坦的抗菌作用。(4)以PVC材料為載體、Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基,將菌液接種于載體上,37℃靜置培養(yǎng),分別于0h及24h予美羅培南、舒巴坦及IDR-1018單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)24h,結(jié)晶紫染色法及激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)觀察生物膜形態(tài)及生物膜內(nèi)活/死菌數(shù)量變化。結(jié)果:(1)AB接種至LB液體培養(yǎng)基后,0~4h為生長遲緩期,4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,直至14h左右細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定生長期;AB于PVC 96孔板中培養(yǎng)至24h即可見低密度紫色膜狀物形成,4d左右形成致密穩(wěn)定的生物膜。(2)MIC:美羅培南64μg/ml、頭孢哌酮鈉256μg/ml、頭孢哌酮/舒巴坦鈉256μg/ml、舒巴坦32μg/ml及IDR-1018 32μg/ml。(3)部分抑菌濃度指數(shù)(FICI):IDR-1018聯(lián)合美羅培南為1.25,兩者聯(lián)用對(duì)AB的聯(lián)合藥敏結(jié)果為無關(guān)作用;IDR-1018聯(lián)合舒巴坦為1.5,兩者聯(lián)用對(duì)AB的聯(lián)合藥敏結(jié)果亦為無關(guān)作用。(4)細(xì)菌接種0h時(shí)予美羅培南、舒巴坦及IDR-1018單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)24h,濃度為64μg/ml的美羅培南或32μg/ml的舒巴坦只能抑制浮游菌生長,而對(duì)生物膜沒有明顯抑制作用;32μg/ml的IDR-1018抑制浮游菌生長同時(shí)可抑制47.8%AB生物膜的形成。16μg/ml的IDR-1018聯(lián)合美羅培南(16μg/ml)或舒巴坦(8μg/ml)后,可完全抑制生物膜的形成。(5)細(xì)菌接種24h后予美羅培南、舒巴坦及IDR-1018單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)24h,單獨(dú)應(yīng)用三種抗菌制劑未見明顯生物膜抑制作用,聯(lián)合應(yīng)用后,隨著IDR-1018濃度逐漸降低,對(duì)生物膜狀態(tài)的AB的抑制作用逐漸減弱。CLSM下可見美羅培南(64μg/ml)或舒巴坦(32μg/ml)單獨(dú)作用后,生物膜內(nèi)活/死菌比例較對(duì)照組無明顯變化,聯(lián)合IDR-1018(64μg/ml或32μg/ml)后,生物膜內(nèi)活菌數(shù)量明顯減少,以死菌為主。結(jié)論:(1)以PVC材料為粘附載體可成功構(gòu)建AB生物膜模型。(2)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)IDR-1018分別與美羅培南或舒巴坦聯(lián)用,對(duì)AB的聯(lián)合藥敏結(jié)果均為無關(guān)作用。(3)生物膜是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因,美羅培南及舒巴坦?jié)舛葹镸IC時(shí),只能抑制浮游菌生長,而對(duì)生物膜狀態(tài)的細(xì)菌效果較差。(4)細(xì)菌未形成生物膜時(shí),予IDR-1018聯(lián)合美羅培南或舒巴坦可有效抑制生物膜的形成。(5)生物膜形成初期(24h),予IDR-1018聯(lián)合美羅培南或舒巴坦可以抑制生物膜的進(jìn)一步成熟。
【圖文】：

生理鹽水沖洗 3 次，用 10μg/ml 的 PI 在 4℃冰箱中避光染色 15min，沖洗 3 次并吸干水分后 40%甘油封閉。2.7 統(tǒng)計(jì)分析采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組生物膜結(jié)晶紫染色半定量檢測(cè)結(jié)果采用單因素方差分析間生物膜結(jié)晶紫染色半定量檢測(cè)結(jié)果采用正交試驗(yàn)方差分析。P<0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1 ATCC BAA-1605 生長曲線如圖 1 所示。細(xì)菌接種至 LB 培養(yǎng)基后，0～4h 為生長遲緩期，細(xì)菌繁殖h 開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，，細(xì)菌以幾何數(shù)級(jí)快速增長，菌液密度迅速增加，4h 左右；第 14h 后細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定生長期，細(xì)菌繁殖速度漸趨下降。

圖 2 ATCC BAA-1605 生物膜形成曲線細(xì)菌接種于 PVC 96 孔板后，24h 時(shí)即有生物膜形成，4d 左右達(dá)到成熟狀態(tài)，并穩(wěn)定存在3 抗菌肽及抗菌藥物的 MIC微量肉湯稀釋法測(cè)得抗菌肽及抗菌藥物的 MIC 分別為美羅培南 64μg/ml、哌酮鈉＞256μg/ml、頭孢哌酮/舒巴坦鈉＞256μg/ml、舒巴坦 32μg/ml 及 IDR-1μg/ml。單用舒巴坦時(shí) MIC 僅為 32μg/ml，而以 2:1 比例配制頭孢哌酮/舒巴坦其 MIC 未見下降反而較舒巴坦單用明顯增加。因此，另做一組以同樣比例配水/舒巴坦，并測(cè)得其 MIC 與頭孢哌酮/舒巴坦鈉相同，MIC＞256μg/ml。這說孢哌酮鈉沒有抑菌效果，其與舒巴坦聯(lián)合應(yīng)用后不發(fā)揮抗菌活性反而稀釋了坦的濃度，使得其 MIC 顯著增加。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再做頭孢哌酮鈉及頭孢哌巴坦鈉與抗菌肽 IDR-1018 的聯(lián)合抑菌試驗(yàn)。4 IDR-1018 聯(lián)合美羅培南或舒巴坦的抗菌作用
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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1 許亞豐;耿先龍;王春新;陳國千;趙琪;周麗珍;糜祖煌;;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶、膜孔蛋白及β-內(nèi)酰胺類靶位編碼基因研究[J];中國抗生素雜志;2014年01期

2 張R

本文編號(hào)：2611803