【摘要】：目前,抗生素的濫用和抗生素耐藥性病原體的迅速增加已經(jīng)對人類構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅,微生物天然產(chǎn)物被認(rèn)為是抗生素的重要替代品�，F(xiàn)已投入使用的大部分天然產(chǎn)物衍生物來源于陸地,但是來源于海洋的活性物質(zhì)也可以為發(fā)現(xiàn)新藥提供寶貴的資源。對比分析表明,與陸地天然產(chǎn)物相比,從海洋來源獲得的天然產(chǎn)物在化學(xué)成分上更加多樣化。本課題從條紋斑竹鯊腸道中分離獲得一株活性菌株,將其命名為GFP-2,對其抗菌活性進(jìn)行初步探究,同時(shí)開展相應(yīng)GFP-2菌制劑在虹鱒養(yǎng)殖中的功效研究�？咕鷮�(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GFP-2菌株對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的抑制作用。對GFP-2菌株進(jìn)行16S rRNA基因檢測,并在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比,表明GFP-2菌株是屬于B.velezensis的一種新型菌株。芽孢桿菌GFP-2現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC),保藏號為CGMCC NO.13337。國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局也受理了該菌株的分離方法及其應(yīng)用,專利申請?zhí)枮?01710044718.4。通過硫酸銨鹽沉淀的方法提取芽孢桿菌GFP-2的胞外代謝產(chǎn)物中的粗蛋白,當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到20%時(shí),發(fā)現(xiàn)有大量沉淀產(chǎn)生。利用濃度為1 mmol/L的Na_3PO_4(pH 7.0)緩沖液將沉淀重懸后可以得到澄清的黃色液體,即為胞外代謝產(chǎn)物中的粗蛋白�？咕鷮�(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該粗提物對枯草芽孢桿菌WB800N和大腸桿菌BL21均有明顯的抑菌圈,說明芽孢桿菌GFP-2是通過分泌蛋白物質(zhì)抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長。通過截留分子量為10 kDa的超濾管對粗蛋白進(jìn)行初步分離,獲得大分子和小分子粗蛋白樣品,分別進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)�？咕鷮�(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是大分子還是小分子粗蛋白樣品,對枯草芽孢桿菌WB800N和大腸桿菌BL21均有明顯的抑菌圈,推測芽孢桿菌GFP-2可能是通過分泌不同大小的蛋白對指示菌株起到抑菌的作用�；赟MRT測序技術(shù),對芽孢桿菌GFP-2進(jìn)行基因組測序,發(fā)現(xiàn)其基因組含有3711個(gè)蛋白編碼序列,在一個(gè)環(huán)狀染色體上(3975220 bp)平均GC含量為46.4%。該基因組可以編碼LCI、YFGAP和hGAPDH樣抗微生物肽(AMPs)及β-1,3-1,4-葡聚糖酶(bgl)。在基因組中可以預(yù)測Difficidin、Bacillibactin、Bacilysin、Surfactin、Butirosin、Macrolactin、Bacillaene、Fengycin和Lanthipeptides等次生代謝物基因簇,還可以預(yù)測Lanthipeptides和LCI等細(xì)菌素基因簇。因此,推測芽孢桿菌GFP-2可能是通過bgl、抗微生物肽、次級代謝物和細(xì)菌素的相互協(xié)作起到抗菌作用。通過bgl鑒定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌GFP-2的代謝產(chǎn)物粗蛋白可以在鑒定培養(yǎng)基中形成明顯的水解圈,說明在該代謝產(chǎn)物粗蛋白中存在bgl類物質(zhì)。為了驗(yàn)證bgl的抗菌活性,首先利用原核表達(dá)系統(tǒng)將bgl克隆、表達(dá)和純化,獲得純度較高的bgl重組酶,然后通過抗菌實(shí)驗(yàn)鑒定其抑菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示bgl重組酶對枯草芽孢桿菌WB800N和大腸桿菌BL21均有明顯的抑菌圈,表明bgl確實(shí)對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用。由此說明芽孢桿菌GFP-2其中一個(gè)抗菌機(jī)制是通過分泌bgl蛋白起到抑菌的作用。在活性菌株GFP-2菌制劑的虹鱒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,投喂GFP-2菌制劑的實(shí)驗(yàn)組虹鱒魚總重量在投喂30個(gè)試驗(yàn)周期后比對照組重811 g,實(shí)驗(yàn)組的飼料轉(zhuǎn)化率也低于對照組0.9。對比對照組,在試驗(yàn)期間內(nèi)投喂GFP-2菌制劑可以提高49.2%的虹鱒存活率,這也為作用于其他魚類或者其他動(dòng)物提供部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為之后新藥的研發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。因此,條紋斑竹鯊腸道微生物來源的芽孢桿菌GFP-2有可能被開發(fā)為一種有效可行的抗菌藥物,并以此來替代目前正在被泛濫使用的抗生素。
【圖文】：

圖 1.3 細(xì)菌和植物來源的結(jié)構(gòu)Fig 1.3 Structures of β-1,3-1,4-glucanase from bacteria and plant工業(yè)中，添加外源 bgl 可以減少釀造業(yè)糖化過程中大麥 β-葡聚糖造成高大麥飼料中大麥飼料的消化率并且減少腸炎等疾病[72-75]。此外，，在應(yīng)用 β-葡聚糖酶例如地衣多糖酶可以控制和降解真菌病原體的菌絲菌如產(chǎn)琥珀酸纖維桿菌[79]、牛鏈球菌[80]、類芽孢桿菌屬[81]、芽孢桿菌菌（Bacillus macerans），解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien證實(shí)具有 bgl 基因。據(jù)報(bào)道，一些真菌也具有 bgl 基因，包括 Co]、Talaromyces emersonii[85]和 Rhizopus microsporus var。高等植物如冬得 bgl 基因[86]。此外，許多研究還報(bào)道了如何改進(jìn) bgl 的熱穩(wěn)定性[69,構(gòu)穩(wěn)定性和催化效率[69, 87, 91]。

圖 3.1 條紋斑竹鯊解剖圖Fig 3.1 The anatomy of chiloscyllium plagiosum離得到的腸道微生物中篩選出一株對枯草芽孢桿菌 WB800N 和大腸桿制作用的菌株，將其命名為 GFP-2，該菌液及菌液上清的抑菌圈都十此確定其為產(chǎn)生抗菌代謝物質(zhì)的研究菌株。圖 3.2 GFP-2 菌株對枯草芽孢桿菌 WB800N 和大腸桿菌 BL21 的抑菌圈。a：陰性對照；b：陽性對照；c：GFP-2 菌株的菌液；d：GFP-2 菌株的上清液
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R915

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳明茹,丘書院,楊圣云,蘇碧惠,陳麗華;條紋斑竹鯊雌性生殖系統(tǒng)的初步研究[J];海洋科學(xué);2002年05期

本文編號：2610465