發(fā)布時(shí)間：2020-03-31 06:26

【摘要】：目的:利用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)活性凝血因子Ⅻ催化結(jié)構(gòu)域(Coagulation factor XII-Serine protease domain,FXII-SPD)及其功能鑒定。方法:蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中查詢凝血因子Ⅻ催化結(jié)構(gòu)域的cDNA序列并按照該序列合成,通過XhoI和SalI雙酶切位點(diǎn)插入到pPICZαA質(zhì)粒載體上,電轉(zhuǎn)導(dǎo)入到感受態(tài)畢赤酵母X33菌株中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白用鎳離子金屬螯合親和層析進(jìn)行初步純化,然后用分子排阻層析進(jìn)一步純化,用蛋白免疫印跡和高效液相色譜-質(zhì)譜鑒定目的蛋白的表達(dá)情況,再進(jìn)一步測(cè)定與其特異性生色底物S-2302的米氏常數(shù)來分析目的蛋白的活性,并檢測(cè)其對(duì)血液中凝血過程的影響。結(jié)果:利用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)能表達(dá)rFXII-SPD(Recombinat coagulation factor XII-Serine protease domain,rFXII-SPD),表達(dá)量可達(dá)20mg/L;提取的rFXII-SPD純度較高,未見其他雜帶;表達(dá)的rFXII-SPD在體外具有酰胺分解活性和可以加速血漿中凝塊形成。結(jié)論:1.在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中順利表達(dá)了rFXII-SPD蛋白。2.成功使用Ni ~(2+)-NTA親和層析以及凝膠過濾方法純化了表達(dá)的rFXII-SPD蛋白,提取的rFXII-SPD純度較高。3.rFXII-SPD蛋白具有體外酰胺分解活性和促進(jìn)凝血發(fā)生的作用。目的:初步探測(cè)人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)與兩種新型抗凝藥物(利伐沙班和阿加曲班)的結(jié)合位點(diǎn)。方法:1.制備HSA-新型抗凝藥物(阿加曲班;利伐沙班)復(fù)合物并生長(zhǎng)HSA-新型抗凝藥物復(fù)合物晶體。2.用浸泡方法獲取HSA-新型抗凝藥物的二元復(fù)合物晶體,先生長(zhǎng)單獨(dú)的HSA晶體,將HSA晶體浸泡于含新型抗凝藥物的池液中,使藥物通過擴(kuò)散進(jìn)入到HSA晶體中,以形成HSA-新型抗凝藥物復(fù)合物晶體。3.將獲得的HSA-新型抗凝藥物二元復(fù)合物晶體送去上海光源同步輻射中心進(jìn)行X-ray衍射實(shí)驗(yàn)。4.解析HSA-新型抗凝藥物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。(1)構(gòu)建模型:獲得原始晶體數(shù)據(jù)后,采用CCP4的molrep程序,以PDB數(shù)據(jù)庫中的HSA晶體結(jié)構(gòu)為模板,運(yùn)用快速旋轉(zhuǎn)和平移函數(shù)尋找正確的原子模型。(2)修正結(jié)構(gòu):獲得適合的模型后,采用Refmac和CNS以及p Henix程序?qū)ζ溥M(jìn)行修正,并確定抗凝藥物的位置。(3)精修結(jié)構(gòu):一旦獲得電子密度圖和合適的坐標(biāo)文件,再使用Coot和PyMOL程序?qū)Y(jié)構(gòu)進(jìn)行精修。結(jié)果:1.人血清白蛋白-阿加曲班二元復(fù)合物的結(jié)晶條件:31%~35%PEG3350,p H7.4 PB,H_2O。2.人血清白蛋白-利伐沙班二元復(fù)合物的結(jié)晶條件:31%~35%PEG3350,p H7.4 PB,H_2O。3.對(duì)收集到的人血清白蛋白-阿加曲班、人血清白蛋白-利伐沙班二元復(fù)合物共晶的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行解析,發(fā)現(xiàn)人血清白蛋白某些氨基酸附近有利伐沙班和阿加曲班電子云密度。結(jié)論:電子云密度提示,阿加曲班和利伐沙班可能與人血清白蛋白有結(jié)合。
【圖文】：

6×His 標(biāo)簽）即構(gòu)建出重組質(zhì)粒 rFXII-SPD-pPICZαA（圖1）。經(jīng)上海博尚有限公司對(duì)重組質(zhì)粒 rFXII-SPD-pPICZαA 的測(cè)序證實(shí)了 FXII-SPD 的閱讀框是正確的（圖 2）。

18圖 2 蛋白序列比對(duì)（序列 1 為 uniprot 上查詢的 Factor XII-SPD 的蛋白序列，，序列 2 為克隆測(cè)序翻譯出來的 Factor XII-SPD 蛋白序列）3.2 蛋白表達(dá)與純化目的蛋白經(jīng)過小量表達(dá)鑒定，如圖 3 所示，1、2、4 號(hào)菌液 含有目的蛋白條帶且雜帶較少；3 號(hào)菌液含有目的條帶但同時(shí)含有較多雜帶；5 號(hào)未誘導(dǎo)菌液未見目的蛋白表達(dá)。收集含有目的蛋白條帶且雜帶較少的洗脫液經(jīng)將洗脫液濃縮后用分子排阻層析法進(jìn)一步純化，在 8.5 mL 和 12.8 mL 處出現(xiàn)了兩個(gè)峰（圖 4），分別代表聚集體和單體 rFXII-SPD 的峰，收集代表單體的目的蛋白。經(jīng) 15%SDS-PAGE 分析見凝膠上只有一條分子量介于 25-35KD 之間蛋白區(qū)帶，說明收集的蛋白純度較高，且均一性良好。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;R96

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本文編號(hào)：2608702