發(fā)布時間：2020-03-29 15:48

【摘要】：隨著人口數(shù)量的不斷增加,生態(tài)環(huán)境遭到破壞,導致環(huán)境中二氧化碳釋放量不斷的增加,最終全球變暖、臭氧空洞大量形成。因此,紫外線大量的透過空洞,輻射到地球表面。紫外線中的中波長紫外線UVB是主要造成皮膚損傷的紫外線,可以引起皮膚的光老化,造成皮膚損傷。所以保護皮膚免受UVB對皮膚的老化成為目前研究的熱點。本研究以兩種羅非魚皮肽TGAGT和LSGTGP為材料,研究其抑制UVB(UltravioletB)誘導HaCaT角質(zhì)細胞光老化的機制。以不同劑量的UVB輻射HaCaT細胞,通過噻唑藍比色法(MTT)篩選出導致細胞半數(shù)致死量劑量為30 mJ/cm~2,建立了細胞損傷模型;通過MTT法證實兩種羅非魚皮肽TGAGT和LSGTGP在10-100μM的濃度范圍內(nèi)沒有細胞毒性,并證實該濃度范圍內(nèi)有對UVB輻射后的細胞活力提高的作用。將兩種羅非魚皮肽分別作用于HaCaT細胞4h再經(jīng)UVB輻射后培養(yǎng)24h,DNA氧化損傷實驗結(jié)果表明兩種羅非魚皮肽對UVB輻射后的細胞氧化損傷的DNA具有保護作用;DCFH-DA法實驗結(jié)果顯示兩種羅非魚皮肽對UVB輻射細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生起到抑制作用,蛋白免疫印跡法(WB)實驗結(jié)果表明兩種羅非魚肽可以增加Glu和SOD含量的表達,維持細胞內(nèi)抗氧化的水平;兩種羅非魚皮肽保護由UVB輻射后的HaCaT細胞,通過WB結(jié)果表明兩種肽經(jīng)過UVB輻射后,HaCaT細胞中MAPK信號通路中,p38、JNK和ERK蛋白表達量增加,當細胞經(jīng)羅非魚皮肽TGAGT保護后,磷酸化的p38和JNK蛋白表達量下降。然而,對ERK的磷酸化沒有起到抑制性作用。隨著羅非魚皮肽LSGTGP的濃度升高,磷酸化的p38、JNK和ERK蛋白表答逐漸減少;WB實驗進一步證明經(jīng)兩種肽保護后再UVB輻射后,磷酸化的p65和IκB蛋白的表達降低。通過細胞免疫熒光實驗結(jié)果表明,兩種羅非魚皮肽TGAGT和LSGTGP保護的HaCaT細胞,隨著肽濃度的增加,細胞中p65的入核情況逐漸減弱,這一結(jié)果直觀的說明了兩種羅非魚皮肽能夠抑制由UVB輻射HaCaT細胞p65的入核,抑制p65的表達;ELISA實驗驗證兩種肽可以降低受UVB輻射后HaCaT細胞MMP-1和MMP-9的分泌,減少了MMP-1和MMP-9的過度表達,使其不能對膠原蛋白過度的降解,因此對膠原起到了保護作用。同時,兩種羅非魚魚皮肽還可以提高I型膠原蛋白的含量,提高I型膠原蛋白自我的修復能力。因此,兩種羅非魚皮肽TGAGT和LSGTGP可以減緩因UVB輻射造成的皮膚損傷,對UVB造成的皮膚光老化起到保護的作用;因此,兩種羅非魚皮肽可以抑制通過ROS產(chǎn)生的氧化應激,及其介導的MAPK和NF-κB信號通路,進而控制細胞中的MMPs并提高細胞中膠原蛋白的含量,具有抑制UVB誘導HaCaT角質(zhì)細胞的光老化作用。
【圖文】：

圖 1-1 實驗技術(shù)路線Fig 1-1 Experimental technical route1.8 本課題研究的目的和意義魚類廢棄物是蛋白質(zhì)，肽和氨基酸的重要來源，具有開發(fā)新型營養(yǎng)保健品的巨大潛力，可替代或?qū)⒑铣伤幬锏臐撛谟泻ψ饔米钚』�。此外，使用這種技術(shù)可以達到雙重目的，即從廉價和豐富的原料開發(fā)高附加值產(chǎn)品，并最大限度地減少魚類廢物的污染潛力。在過去幾十年中，關(guān)于魚類副產(chǎn)品回收及其潛在生物活性的知識大大增加。盡管如此，需要更多的研究來更好地理解魚類副產(chǎn)物蛋白質(zhì)水解物發(fā)揮其生物活性的機制。此外，必須進行進一步的體內(nèi)研究以回答它們在機體中的吸收和生物利用度的問題，以開發(fā)用于人類功能性食品的營養(yǎng)保健品和針對多種疾病的天然藥物的食品添加劑。本課題的研究，通過查閱大量關(guān)于羅非魚魚皮多肽的相關(guān)文獻，選取兩種羅非魚魚皮肽 TGAGT 和 LSGTGP[124-125]，并根據(jù)序列進行合成。并對其跟蹤分析兩種樣品是否具備抑制光老化的作用，研究其活性機制。為預防 UVB 誘導皮膚光老化的海洋

圖 2-1 UVB 輻射對 HaCaT 細胞相對活力的影響Fig 2-1 Effect of UVB radiation on the relative viability of HaCaT cells性實驗種羅非魚皮肽 TGAGT 和 LSGTGP 的毒性進行檢測，分別的濃度為 10、20、50 和 100 μM 的兩種肽培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的MT 法檢測細胞活力，，結(jié)果如圖 2-2。實驗結(jié)果表明，兩種羅SGTGP 濃度在 10、20、50 和 100 μM 時，與空白組相比，加樣力不受影響，表示在該濃度范圍內(nèi)，兩種樣品不具有細胞毒性進行后續(xù)的實驗，
【學位授予單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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本文編號：2606186