【摘要】：自首例艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合征,acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)患者在美國(guó)被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)以來(lái),AIDS已成為一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。作為唯一一個(gè)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)用于AIDS患者臨床治療的多肽膜融合抑制劑,恩夫韋肽(Enfuvirtide,T20,又稱DP178)的發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟了利用多肽類藥物控制HIV感染的新領(lǐng)域,在一定程度上改善了患者的生命質(zhì)量,可作為“雞尾酒療法”高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療失敗的補(bǔ)救措施。但在隨后的治療研究過(guò)程中暴露的一些弊端,比如多次用藥易產(chǎn)生耐藥性、生物利用度低、對(duì)HIV-2抗病毒活性弱等,限制了 T20進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。T1249是繼T20之后開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的第二代多肽膜融合抑制劑,彌補(bǔ)了 T20抗病毒過(guò)程中出現(xiàn)的不足,對(duì)HIV-1各亞型、HIV-2/SIV及T20耐藥病毒株均具有較高的抗病毒活性。但隨后由于制劑、分子量大等問(wèn)題限制了 T1249進(jìn)一步的研究應(yīng)用。因此,更具臨床應(yīng)用價(jià)值的多肽膜融合抑制劑亟待研發(fā)設(shè)計(jì)。本課題聚焦T20多肽膜融合抑制劑,探討其具體抗病毒作用機(jī)制,同時(shí)指導(dǎo)新型膜融合抑制劑的設(shè)計(jì)。首先,我們通過(guò)病毒單次侵染抑制實(shí)驗(yàn)及圓二色譜(circular dichroism,CD)實(shí)驗(yàn)證明了色氨酸富集區(qū)(tryptophan-rich motif,TRM)在 T20抗病毒活性及其與相應(yīng)NHR結(jié)合形成六螺旋體(six-helixbundle,6-HB)結(jié)構(gòu)的重要性;為了進(jìn)一步探討TRM在T20抗病毒活性中的作用,并研發(fā)設(shè)計(jì)更具潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的膜融合抑制劑,我們隨后用同樣具有高度疏水特性且能與靶細(xì)胞膜發(fā)生相互作用的脂肪酸(軟脂酸,C16)取代T20羧基端的TRM,從而獲得新的脂肽LP-40。相比T20及早期報(bào)道的以T20序列為模板設(shè)計(jì)的脂肽DP-C16,LP-40無(wú)論是與NHR結(jié)合能力,亦或抗病毒活性都有明顯提高。研究發(fā)現(xiàn),不同于早期設(shè)計(jì)合成的作用于gp41 NHR疏水口袋“pocket”區(qū)的脂肽LP-11,在多肽序列與脂肪酸之間Linker的添加不僅沒(méi)有因?yàn)樵鰪?qiáng)多肽的靈活性而使其抗病毒能力增強(qiáng),反而嚴(yán)重削弱,這表明,LP-40與LP-11可能以完全不同的模式同gp41 NHR發(fā)生相互作用。有趣的是,隨后的研究發(fā)現(xiàn),盡管LP-40抗病毒活性低于LP-11,但在HIV-1各亞型包膜蛋白介導(dǎo)的膜融合過(guò)程中卻表現(xiàn)出強(qiáng)有力的抑制活性,而且兩種多肽聯(lián)合使用具有中等程度的協(xié)同作用,這一方面進(jìn)一步表明兩種多肽作用機(jī)制的不同,另一方面也表明,對(duì)于HIV-1來(lái)說(shuō),病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的機(jī)制與由其包膜蛋白介導(dǎo)的膜融合機(jī)制之間可能存在一定的差異,在患者體內(nèi),或許這兩個(gè)過(guò)程并不是以完全相同的模式在介導(dǎo)病毒傳播。此外,盡管LP-40在很多方面的特性優(yōu)于其模板多肽T20,但其對(duì)T20耐藥株及HIV-2病毒株依舊表現(xiàn)較弱的抗病毒活性。因此,受LP-40脂肽設(shè)計(jì)的啟發(fā),也為了克服T20、T1249及LP-40在抗病毒活性中的不足,我們以T1249序列為模板,同樣用脂肪酸C16取代其羧基端的TRM序列,合成一新的脂肽LP-46。隨后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比T20、T1249及LP-40,LP-46對(duì)HIV-1的抗病毒活性IC50值接近皮摩爾濃度,對(duì)HIV-2/SIV及T20耐藥株也表現(xiàn)出極高的抗病毒活性�？傊�,我們的研究結(jié)果不僅提供了更具潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的多肽膜融合抑制劑,而且以T20/LP-40為探針從新的角度進(jìn)一步揭示了 HIV膜融合的分子作用機(jī)制。
【圖文】：

激活ＨＩＶ基因的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)病毒ｍＲＮＡ的翻譯；種順式激活因子，能對(duì)ｅｎｖ和中順式作用抑制序列去抑ｎｖ基因的表達(dá)，以合成相應(yīng)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白；６．７ｚｅ／基因編碼ｐ的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，以推遲病毒復(fù)制；７．邋ｗｊ基因?qū)Γ龋桑植㈨懹坞xＨＩＶ的感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播；８．邋基因ＨＩＶ的有效復(fù)制及病毒體的裝配與成熟必不可少；９．邋ｖｐ／＊基因轉(zhuǎn)錄激活物，在體內(nèi)繁殖周期中起一定作用。由上述這些調(diào)白在病毒基因組ＲＮＡ的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、蛋白質(zhì)翻譯及分重要的作用。逡逑ｇｐ４１邋ｐ１７邋ｍａｔｒｉｘ逡逑

獨(dú)的Ｎ３９在ＰＢＳ溶液中以無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象存在，自身序列之間不能形成螺旋套螺逡逑旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象，但添加同等濃度的Ｔ２０后，兩者相互作用卻可以形成典型的６－ＨＢ結(jié)逡逑構(gòu)，該復(fù)合物在２０８邋ｎｍ和２２２邋ｎｍ均出現(xiàn)最大負(fù)峰值，ａ－螺旋含量百分比約占５２．０４邋％，逡逑Ｋ值約４２．０６邋°Ｃ，具有一定的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。而ＴＲＭ序列的缺失導(dǎo)致Ｔ２０ＡＴＲＭ無(wú)逡逑法誘導(dǎo)Ｎ３９與之相互作用形成穩(wěn)定的ａ－螺旋結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。逡逑３．２邋Ｔ２０序列中的ＴＲＭ與ＮＨＲ相應(yīng)位置上的ＦＰＰＲ序列之間存在一定的相互作用逡逑鑒于ＴＲＭ的缺失嚴(yán)重影響Ｔ２０與Ｎ３９結(jié)合形成穩(wěn)定６－ＨＢ結(jié)構(gòu)的能力，因此，逡逑我們進(jìn)一步探討ＴＲＭ具體作用靶點(diǎn)和機(jī)制。根據(jù)ＨＩＶ感染靶細(xì)胞的膜融合發(fā)夾結(jié)逡逑構(gòu)模型及ＴＲＭ在ｇｐ４１結(jié)構(gòu)中的位置（圖４），我們推測(cè)Ｔ２０羧基端的ＴＲＭ對(duì)應(yīng)的逡逑作用靶序列為ＦＰＰＲ序列。為了探宄ＦＰＰＲ序列在Ｔ２０與ＮＨＲ相互作用時(shí)扮演的角逡逑色，我們合成了另一個(gè)多肽，Ｎ３９ＡＦＰＰＲ，即氨基端缺失了邋ＦＰＰＲ片段的Ｎ３９多肽。逡逑隨后，，我們使用等溫滴定量熱儀ＩＴＣ方法檢測(cè)了邋ＦＰＰＲ序列的存在與否是否會(huì)影響逡逑Ｔ２０與Ｎ３９相互作用過(guò)程中的熱動(dòng)力學(xué)變化，即通過(guò)測(cè)定兩種多肽相互作用時(shí)的吸逡逑熱或放熱來(lái)計(jì)算其親和力常數(shù)（Ｋ）、化學(xué)反應(yīng)量（ｎ）、焓（ＡＨ）和熵（ＡＳ）。逡逑Ｔｕｎｅ邋（ｎｕｉｉ）邐Ｔｉｍｅ邋（ｎｕｎ）邐Ｔｍｉｅ邋（ｎｉｍ）逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：2606089