【摘要】：自首例艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合征,acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)患者在美國被檢測發(fā)現(xiàn)以來,AIDS已成為一種嚴重危害人類健康的疾病。作為唯一一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準用于AIDS患者臨床治療的多肽膜融合抑制劑,恩夫韋肽(Enfuvirtide,T20,又稱DP178)的發(fā)現(xiàn)開辟了利用多肽類藥物控制HIV感染的新領域,在一定程度上改善了患者的生命質量,可作為“雞尾酒療法”高效抗逆轉錄病毒治療失敗的補救措施。但在隨后的治療研究過程中暴露的一些弊端,比如多次用藥易產(chǎn)生耐藥性、生物利用度低、對HIV-2抗病毒活性弱等,限制了 T20進一步的臨床應用。T1249是繼T20之后開發(fā)設計的第二代多肽膜融合抑制劑,彌補了 T20抗病毒過程中出現(xiàn)的不足,對HIV-1各亞型、HIV-2/SIV及T20耐藥病毒株均具有較高的抗病毒活性。但隨后由于制劑、分子量大等問題限制了 T1249進一步的研究應用。因此,更具臨床應用價值的多肽膜融合抑制劑亟待研發(fā)設計。本課題聚焦T20多肽膜融合抑制劑,探討其具體抗病毒作用機制,同時指導新型膜融合抑制劑的設計。首先,我們通過病毒單次侵染抑制實驗及圓二色譜(circular dichroism,CD)實驗證明了色氨酸富集區(qū)(tryptophan-rich motif,TRM)在 T20抗病毒活性及其與相應NHR結合形成六螺旋體(six-helixbundle,6-HB)結構的重要性;為了進一步探討TRM在T20抗病毒活性中的作用,并研發(fā)設計更具潛在臨床應用價值的膜融合抑制劑,我們隨后用同樣具有高度疏水特性且能與靶細胞膜發(fā)生相互作用的脂肪酸(軟脂酸,C16)取代T20羧基端的TRM,從而獲得新的脂肽LP-40。相比T20及早期報道的以T20序列為模板設計的脂肽DP-C16,LP-40無論是與NHR結合能力,亦或抗病毒活性都有明顯提高。研究發(fā)現(xiàn),不同于早期設計合成的作用于gp41 NHR疏水口袋“pocket”區(qū)的脂肽LP-11,在多肽序列與脂肪酸之間Linker的添加不僅沒有因為增強多肽的靈活性而使其抗病毒能力增強,反而嚴重削弱,這表明,LP-40與LP-11可能以完全不同的模式同gp41 NHR發(fā)生相互作用。有趣的是,隨后的研究發(fā)現(xiàn),盡管LP-40抗病毒活性低于LP-11,但在HIV-1各亞型包膜蛋白介導的膜融合過程中卻表現(xiàn)出強有力的抑制活性,而且兩種多肽聯(lián)合使用具有中等程度的協(xié)同作用,這一方面進一步表明兩種多肽作用機制的不同,另一方面也表明,對于HIV-1來說,病毒進入靶細胞的機制與由其包膜蛋白介導的膜融合機制之間可能存在一定的差異,在患者體內,或許這兩個過程并不是以完全相同的模式在介導病毒傳播。此外,盡管LP-40在很多方面的特性優(yōu)于其模板多肽T20,但其對T20耐藥株及HIV-2病毒株依舊表現(xiàn)較弱的抗病毒活性。因此,受LP-40脂肽設計的啟發(fā),也為了克服T20、T1249及LP-40在抗病毒活性中的不足,我們以T1249序列為模板,同樣用脂肪酸C16取代其羧基端的TRM序列,合成一新的脂肽LP-46。隨后的實驗結果表明,相比T20、T1249及LP-40,LP-46對HIV-1的抗病毒活性IC50值接近皮摩爾濃度,對HIV-2/SIV及T20耐藥株也表現(xiàn)出極高的抗病毒活性�？傊�,我們的研究結果不僅提供了更具潛在臨床應用價值的多肽膜融合抑制劑,而且以T20/LP-40為探針從新的角度進一步揭示了 HIV膜融合的分子作用機制。
【圖文】：

激活ＨＩＶ基因的轉錄并促進病毒ｍＲＮＡ的翻譯；種順式激活因子，能對ｅｎｖ和中順式作用抑制序列去抑ｎｖ基因的表達，以合成相應的病毒結構蛋白；６．７ｚｅ／基因編碼ｐ的表達有負調控作用，以推遲病毒復制；７．邋ｗｊ基因對ＨＩＶ并響游離ＨＩＶ的感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內傳播；８．邋基因ＨＩＶ的有效復制及病毒體的裝配與成熟必不可少；９．邋ｖｐ／＊基因轉錄激活物，在體內繁殖周期中起一定作用。由上述這些調白在病毒基因組ＲＮＡ的轉錄、轉錄后加工、蛋白質翻譯及分重要的作用。逡逑ｇｐ４１邋ｐ１７邋ｍａｔｒｉｘ逡逑

獨的Ｎ３９在ＰＢＳ溶液中以無規(guī)則卷曲構象存在，自身序列之間不能形成螺旋套螺逡逑旋結構構象，但添加同等濃度的Ｔ２０后，兩者相互作用卻可以形成典型的６－ＨＢ結逡逑構，該復合物在２０８邋ｎｍ和２２２邋ｎｍ均出現(xiàn)最大負峰值，ａ－螺旋含量百分比約占５２．０４邋％，逡逑Ｋ值約４２．０６邋°Ｃ，具有一定的結構穩(wěn)定性。而ＴＲＭ序列的缺失導致Ｔ２０ＡＴＲＭ無逡逑法誘導Ｎ３９與之相互作用形成穩(wěn)定的ａ－螺旋結構，嚴重影響復合物結構的穩(wěn)定性。逡逑３．２邋Ｔ２０序列中的ＴＲＭ與ＮＨＲ相應位置上的ＦＰＰＲ序列之間存在一定的相互作用逡逑鑒于ＴＲＭ的缺失嚴重影響Ｔ２０與Ｎ３９結合形成穩(wěn)定６－ＨＢ結構的能力，因此，逡逑我們進一步探討ＴＲＭ具體作用靶點和機制。根據(jù)ＨＩＶ感染靶細胞的膜融合發(fā)夾結逡逑構模型及ＴＲＭ在ｇｐ４１結構中的位置（圖４），我們推測Ｔ２０羧基端的ＴＲＭ對應的逡逑作用靶序列為ＦＰＰＲ序列。為了探宄ＦＰＰＲ序列在Ｔ２０與ＮＨＲ相互作用時扮演的角逡逑色，我們合成了另一個多肽，Ｎ３９ＡＦＰＰＲ，即氨基端缺失了邋ＦＰＰＲ片段的Ｎ３９多肽。逡逑隨后，，我們使用等溫滴定量熱儀ＩＴＣ方法檢測了邋ＦＰＰＲ序列的存在與否是否會影響逡逑Ｔ２０與Ｎ３９相互作用過程中的熱動力學變化，即通過測定兩種多肽相互作用時的吸逡逑熱或放熱來計算其親和力常數(shù)（Ｋ）、化學反應量（ｎ）、焓（ＡＨ）和熵（ＡＳ）。逡逑Ｔｕｎｅ邋（ｎｕｉｉ）邐Ｔｉｍｅ邋（ｎｕｎ）邐Ｔｍｉｅ邋（ｎｉｍ）逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R91

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本文編號：2606089