【摘要】：背景和目的:特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary fibrosis,IPF)是一類原因不明的慢性、進行性、纖維化的間質(zhì)性肺病,是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia,IIPs)中最常見的一種類型~([1])。IPF患者通常被診斷為預(yù)后不良,針對IPF的治療藥物很少,且療效欠佳、毒副作用較大,因此迫切需要開發(fā)新的藥物來治療IPF.研究表明上皮細胞的間質(zhì)性轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)過程和IPF的產(chǎn)生有很大關(guān)系;上皮細胞在發(fā)生EMT的過程中,細胞發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)變,呈現(xiàn)為梭狀,細胞輪廓變得模糊不清,細胞內(nèi)的標志蛋白表達下調(diào)(如E-Cad蛋白),而間質(zhì)細胞的標志蛋白表達上調(diào)(如α-SMA蛋白)~([2])。而EMT過程主要是在轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的作用下啟動的,因此阻斷肺組織細胞TGF-β_1信號的傳導(dǎo),即可阻止EMT過程的發(fā)生,預(yù)期達到預(yù)防和治療IPF的目的~([3])。參考現(xiàn)有的TGF-β_1抑制劑結(jié)構(gòu)和相關(guān)研究支持~([4]),我們計劃合成一系列稠合3-氨基-1,2,4-三唑類化合物,總結(jié)并參考前人的合成方法,通過不斷優(yōu)化,使反應(yīng)在較溫和的條件下進行,并以較高的收率得到產(chǎn)物。然后選用A549細胞首先來評價化合物的細胞毒性,再構(gòu)建肺纖維化體外模型,來檢測系列化合物對EMT過程的逆轉(zhuǎn)活性。方法:1.化合物合成:室溫下以乙醇為溶劑,向芳基肼中加入異硫氰酸酯進行加成反應(yīng),然后在堿性條件下(碳酸鉀)進行I_2介導(dǎo)的氧化脫硫、環(huán)化反應(yīng),產(chǎn)生相應(yīng)的稠合3-氨基-1,2,4-三唑類化合物。2.化合物對A549細胞毒性檢測:用25、50、100、200、400μM化合物或陽性對照(SB-431542)作用于A549細胞72 h后采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色分析法檢測細胞生長抑制情況。3.化合物對EMT逆轉(zhuǎn)活性檢測:用10 ng/mL的TGF-β_1、10μM化合物或陽性對照(SB-431542)作用于A549細胞48 h后通過免疫熒光法和免疫蛋白印跡(Western Blot)法檢測細胞中E-Cad蛋白和α-SMA蛋白的表達情況。結(jié)果:1.成功合成了稠合3-氨基-1,2,4-三唑類化合物,產(chǎn)物收率在41%-97%之間。這種合成方法操作簡單、條件溫和且收率較高,適應(yīng)性較好,并且可以方便地進行克級規(guī)模的合成;反應(yīng)的關(guān)鍵催化氧化劑碘單質(zhì)廉價、易得且綠色無污染。2.化合物以及陽性對照對A549細胞的毒性作用均較小,CC_(50)值均大于300μM.化合物1a、1d、1e、1k、1n、1r、1t、1u、1z和1aa的細胞毒性較小,CC_(50)值均大于1000μM;化合物1l和1y細胞毒性略大,CC_(50)值分別為302μM和387μM;其余化合物1g、1h、1s和1v的CC_(50)值在400μM到1000μM之間。陽性對照化合物CC_(50)值為450μM.3.通過免疫熒光實驗篩選出六個活性較好的化合物,分別為1d、1g、1n、1r、1y和1aa.又通過Western Blot檢測,對比模型組和陽性組有兩個化合物1g和1r能明顯上調(diào)E-Cad蛋白的表達,下調(diào)α-SMA蛋白的表達,活性和陽性對照化合物相近。通過構(gòu)效關(guān)系分析可知,3位氨基接芳基的化合物,其中苯環(huán)對位有氟原子的1d和有氰基取代的1g活性較好,其中1g活性較為突出;3位氨基接脂肪烴基的1n和1r活性都較好,其中1r的環(huán)己基活性更好一些;稠合環(huán)上加入氮原子取代后,其中加入硫甲基的1z活性較差,而1y和1aa活性則較好。結(jié)論:1.給出了一種較好的合成稠合3-氨基-1,2,4-三唑類化合物的方法。2.所合成化合物對逆轉(zhuǎn)EMT過程有一定的活性,提示可能有治療IPF的作用。
【圖文】：

并且隨著年齡的增長而增加。IPF 的死亡率似乎在全球范圍內(nèi)逐步上升，2014 年，歐洲有 28,000 至 65,000人因 IPF 死亡，美國有 13,000 至 17,000 人因 IPF 死亡[11, 12]。與患病率一樣，男性 IPF 死亡率高于女性，隨年齡增長而增加，并且似乎越來越普遍。通過篩查病例并綜合考慮其他因素發(fā)現(xiàn) IPF 導(dǎo)致死亡的原因有：呼吸衰竭、心血管疾病和肺癌，其中呼吸衰竭所占比例較高，約為 60%[13]。奧爾森等人[14]研究了美國 1992年至 2003 年 IPF 的死亡率，12 年間死亡人數(shù)增加 28.4%，死亡率增加 41.3%.IPF 是一種臨床異質(zhì)性疾病，但其預(yù)后總體較差，中位生存期為 3 4 年[15]。此外 IPF 的治療費用較高，在國外直接治療費用約為 25,000 美元/人年，比乳腺癌和許多其他嚴重疾病都要高[16]。確切地說，IPF 患病率和發(fā)病率趨勢正在上升。人們普遍認為，IPF 發(fā)病率約為每 10 萬人中每年有 10 例，而對 50 歲以下的人群幾乎不發(fā)病。它在男性中比在女性中更常見，并且可以在所有病例數(shù)據(jù)中觀察到。雖然世界衛(wèi)生組織對全球 IPF 患者沒有做明確的統(tǒng)計，但是 IPF 作為間質(zhì)性肺病的一種主要類型，其患者數(shù)可以通過間質(zhì)性肺病的患者數(shù)據(jù)中體現(xiàn)出來（圖 1）。

化合物對A549細胞形態(tài)及細胞中α-SMA和E-Cad蛋白表達的影響（用10ng/mL的TGF-β建立模型，，化合物和陽性對照濃度均為10μM）
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914;R96

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本文編號：2605458