【摘要】：糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)是一種具有較高負(fù)電荷的直鏈多糖,常以游離狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中或通過共價(jià)鍵與核心蛋白結(jié)合后以糖蛋白的形式錨定于細(xì)胞表面。在多種蛋白質(zhì)受體或者趨化因子輔助下,GAGs在細(xì)胞粘附,炎癥反應(yīng),發(fā)育等許多生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)作為GAGs的一個(gè)重要分支,因其高黏度和低壓縮性等獨(dú)特的流變學(xué)特性,使之成為理想的關(guān)節(jié)腔和眼部潤滑液成分,已被廣泛用于臨床中關(guān)節(jié)炎及干眼病的治療。目前,市售的CS多由動(dòng)物組織中分離提取所得,這種生產(chǎn)CS的工藝流程存在許多缺點(diǎn),容易造成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不均一、雜質(zhì)污染等問題,這明顯制約了 CS作為藥物在臨床應(yīng)用中的發(fā)展。因此,開發(fā)非動(dòng)物來源生產(chǎn)工藝,高效生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)均一的CS是非常迫切的。E.coli O5:K4:H4(ATCC 23502)是一種尿路致病性大腸桿菌,屬于2型E.coli,其莢膜多糖通常被稱為K4CPS。該莢膜多糖是由帶著果糖支鏈(果糖以β鍵連接在葡萄糖醛酸(GlcA)的C-3位上)的軟骨素重復(fù)二糖單元葡萄糖醛酸β(1-3)-N-乙酰氨基半乳糖β(1-4)(GlcA β(1-3)-GalNAc β(1-4))構(gòu)成,是一種潛在的軟骨素發(fā)酵生產(chǎn)菌株。然而野生型菌株的多糖產(chǎn)量一般較低,并不能滿足商業(yè)化生產(chǎn)需求,所以研究K4CPS合成基因簇所編碼的多糖合成關(guān)鍵酶,對(duì)于提高K4多糖微生物發(fā)酵產(chǎn)量和開發(fā)新的化學(xué)酶法合成CS途徑有著重要意義。目前,E.coli O5:K4:H4的全基因組已經(jīng)完成,其中,K4CPS合成基因簇所編碼的KfoA的生物化學(xué)特征并未被明確研究過。然而,經(jīng)過KfoA(登錄號(hào)CCQ00728.1)序列與大腸桿菌中普遍存在的尿苷二磷酸葡萄糖4位異構(gòu)酶(UDP-Glc-4-epi)GalE-E.coli(登錄號(hào)CCQ02734.1)序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),KfoA與GalE-E.coli具有約60%的相似性。于是我們假設(shè),在K4CPS合成過程中,KfoA通過將尿苷二磷酸N乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)4位異構(gòu)的形式,負(fù)責(zé)尿苷二磷酸N乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)的提供,所以本課題對(duì)KfoA的底物選擇性及其機(jī)制進(jìn)行了體外研究。首先通過體外構(gòu)建pET28a(+)-His-KfoA重組表達(dá)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了 KfoA的體外可溶性高效表達(dá),建立了穩(wěn)定的分離純化步驟,獲得了大量KfoA蛋白。并且建立了毛細(xì)管電泳離線檢測(cè)法,確定了體外重組表達(dá)KfoA的UDP-GlcNAc/Glc 4位異構(gòu)酶(UDP-GlcNAc/Glc-4-epi)活性。其次,為解決由于這四種尿苷二磷酸單糖的結(jié)構(gòu)差異甚微而造成的檢測(cè)困難,本課題建立了兩種新型快速檢測(cè)法:基于毛細(xì)管電泳在線檢測(cè)EMMA法原理建立的UDP-G1cNAc/Glc-4-epi活性檢測(cè)法和偶聯(lián)軟骨素合酶KfoC的乙酰化底物(UDP-GlcNAc)4位異活性檢測(cè)法。這兩種新型活性檢測(cè)法的建立使檢測(cè)更加便捷,實(shí)現(xiàn)了活性檢測(cè)的高效率,低成本。并且KfoA(或GalE-E.coli)和KfoC偶聯(lián)的體外催化反應(yīng)在一定程度上模擬了 K4CPS的體內(nèi)延伸過程,這使得我們?cè)隍?yàn)證KfoA活性的同時(shí),提供了 KfoA是K4CPS體內(nèi)生物合成過程中比GalE-E.coli更高效生成UDP-GalNAc的催化酶的直接證據(jù)。最后,通過酶促動(dòng)力學(xué)及轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了相比于UDP-glucose,體外重組表達(dá)的KfoA對(duì)于乙�；暮塑账峄罨瘑翁�(UDP-GlcNAc)表現(xiàn)出明顯的底物偏好性。并且,在以UDP-GlcNAc為底物時(shí),其催化效率、親和力及最大反應(yīng)速率均要大于GalE-E.coli。然而通過KfoA與尿苷二磷酸葡萄糖4位異構(gòu)酶(UDP-Glc-4-epi)家族即GalE家族成員進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),相比于各亞型E.coli中共有的UDP-Glc-4-epi,KfoA與GalE家族group 2組成員(homo-GalE和Gne-B7)的氨基酸序列相似度最高,同源性最好。然而該酶對(duì)于乙酰化底物(UDP-GlcNAc)卻有著強(qiáng)烈的偏好性,這種底物選擇性卻與group 3成員更為相似。所以,為了探究KfoA這種獨(dú)特底物偏好性的分子機(jī)制,本課題通過KfoA與GalE家族其他成員的氨基酸序列分析后,對(duì)特定氨基酸位點(diǎn)突變,進(jìn)而對(duì)各突變體與野生型KfoA轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)的研究,確定了 KfoA乙酰化底物偏好性的關(guān)鍵氨基酸。最終通過蛋白質(zhì)同源建模與分子對(duì)接等生物信息學(xué)手段分析,初步揭示了相關(guān)氨基酸位點(diǎn)影響KfoA底物選擇性的分子機(jī)制。綜上所述,本課題在體外成功的重組表達(dá)了大腸桿菌K4CPS合成基因簇所編碼的 UDP-Glc-4-epi KfoA,確定了其 UDP-GlcNAc/Glc-4-epi 活性。并且建立了兩種新型快速檢測(cè)UDP-GlcNAc/Glc-4-epi活性的方法,實(shí)現(xiàn)了活性檢測(cè)的高效率,低成本。最后通過酶促動(dòng)力學(xué)及轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn),聯(lián)合蛋白質(zhì)同源建模與分子對(duì)接等生物信息學(xué)手段,發(fā)現(xiàn)了 E.coli 05:K4:H4中UDP-Glc-4-epi KfoA對(duì)于乙�；孜�(UDP-GlcNAc)具有強(qiáng)烈的偏好性,確定了其在K4CPS合成中的關(guān)鍵作用,并初步揭示了相關(guān)氨基酸位點(diǎn)影響KfoA底物選擇性的分子機(jī)制,為后續(xù)包括KfoA在內(nèi)的GalE家族工具酶分子的改造提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

圖１－２大腸桿菌Ｋ４莢膜多糖合成示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ邋Ｋ４ＣＰＳ逡逑

圖1-3兩步放射法測(cè)定UDP-GIe-4-epi活性〔幸表示被aH標(biāo)記)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R914

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4 王s，

本文編號(hào)：2603123