【摘要】：目的:可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors,SNARE)介導(dǎo)的膜融合在囊泡運(yùn)輸及神經(jīng)遞質(zhì)釋放中發(fā)揮重要作用。最近的研究證實,包括N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)型谷氨酸受體在內(nèi)的突觸后受體的膜運(yùn)輸,也依賴于SNARE蛋白介導(dǎo)的胞吐作用(Exocytosis)�，F(xiàn)已知,NMDA受體在痛覺敏化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,SNARE復(fù)合物也參與突觸可塑性。然而,脊髓背角淺層神經(jīng)元中SNARE復(fù)合物確切的組成形式及其功能尚不明確。本研究將探討脊髓背角SNARE復(fù)合物的主要組成及其在慢性炎性疼痛中的可能作用。方法:采用免疫熒光組織化學(xué)法觀察脊髓背角SNAP25的分布;利用免疫共沉淀、免疫印跡法調(diào)查大鼠脊髓背角SNARE蛋白家族之間的相互作用;大鼠足底皮下注射完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant,CFA)建立慢性炎性疼痛模型,通過鞘內(nèi)注射可干擾SNARE復(fù)合物形成的多肽pep-SNAP25,探究外周炎癥對脊髓背角SNARE核心復(fù)合物組裝的調(diào)控作用;利用免疫共沉淀、免疫印跡、膜蛋白生物素標(biāo)記法、行為學(xué)等方法,探究脊髓背角SNARE復(fù)合物參與痛覺調(diào)控的分子機(jī)制。結(jié)果:(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,SNAP25大量分布在脊髓灰質(zhì)淺層的背角神經(jīng)元中,并且與突觸后標(biāo)記物PSD95(postsynaptic density protein of 95 kDa)呈共分布,而其同源蛋白SNAP23主要分布在脊髓白質(zhì)周圍的神經(jīng)纖維束中;(2)用抗SNAP25特異性抗體可從大鼠脊髓背角裂解液中免疫共沉淀出syntaxin1、syntaxin2、syntaxin3、syntaxin4、VAMP1、VAMP2、Munc18-1、Munc18-2和Munc18-3,但所沉淀出的syntaxin4、VAMP2和Munc18-1的相對含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于它們的同源物;(3)用抗syntaxin4特異性抗體也可從大鼠脊髓背角裂解液中免疫共沉淀出SNAP25、VAMP2和Munc18-1,提示:在脊髓背角,SNAP25、syntaxin4、VAMP2和Munc18-1可主導(dǎo)性組成SNARE核心復(fù)合物;(4)足底皮下注射CFA可顯著增加SNAP25免疫共沉淀物中syntaxin4、VAMP2和Munc18-1的相對含量;(5)足底皮下注射CFA也可顯著增加syntaxin4免疫共沉淀物中SNAP25、VAMP2和Munc18-1的相對含量,提示:外周炎癥可促進(jìn)脊髓背角SNAP25/syntaxin4/VAMP2/Munc18-1核心復(fù)合物的組裝;(6)鞘內(nèi)給予γ-氨基丁酸A型受體(γ-aminobutyric acid type A receptor,GABA_A受體)拮抗劑bicuculline(0.5μg)或NMDA受體激動劑NMDA(1.0μg),可顯著提升SNAP25免疫共沉淀物中syntaxin4、VAMP2和Munc18-1的相對含量;(7)鞘內(nèi)給予NMDA受體拮抗劑D-APV(1.0μg),可顯著抑制bicuculline增強(qiáng)SNAP25與syntaxin4、VAMP2、Munc18-1相互作用的效應(yīng),表明:脊髓背角SNARE復(fù)合物的組裝受到神經(jīng)活動及NMDA受體活性的密切調(diào)控;(8)鞘內(nèi)注射能干擾SNARE蛋白間相互作用的多肽pep-SNAP25,可顯著抑制炎性大鼠包含GluN2B亞基的NMDA受體(GluN2B subunit-containing NMDA receptors,GluN2BRs)的膜表達(dá)和突觸表達(dá),提示:SNARE復(fù)合物在GluN2B受體的胞吐作用中發(fā)揮重要作用;(9)鞘內(nèi)注射pep-SNAP25能劑量依賴性地抑制CFA所引發(fā)的機(jī)械性縮足閾值(paw withdrawal thresholds,PWTs)和熱縮足潛伏期(paw withdrawal latencies,PWLs)的降低,提示:干擾SNAP25/syntaxin4/VAMP2/Munc18-1復(fù)合物可有效抑制慢性炎性疼痛。結(jié)論:在脊髓背角神經(jīng)元中,SNAP25、syntaxin4、VAMP2和Munc18-1可主導(dǎo)性組成SNARE復(fù)合物。外周炎癥可促進(jìn)此復(fù)合物的組裝,進(jìn)而調(diào)控NMDA受體的胞吐作用,提高突觸表達(dá)。干擾此復(fù)合物的形成可緩解外周炎癥誘發(fā)的機(jī)械性痛覺超敏與熱痛覺過敏。
【圖文】：

第三章 實驗結(jié)果3.1 SNAP25在脊髓背角的分布SNAP25及其同源蛋白SNAP23，是普遍存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)SNARE復(fù)合物的主要組分，并已被證實在突觸后膜受體的胞吐中發(fā)揮重要作用[27]。因此，我們首先利用免疫組織化學(xué)，考察了這兩種蛋白在脊髓背角的分布特點(diǎn)。正常大鼠L4-L5節(jié)段脊髓切片，用抗SNAP25或SNAP23的特異性抗體與突觸后標(biāo)記物PSD95的特異性抗體進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記染色。結(jié)果顯示：SNAP25大量分布于脊髓背角灰質(zhì)中，且主要分布在灰質(zhì)淺層神經(jīng)元 (圖3-1)。同時，在灰質(zhì)周圍的神經(jīng)纖維束中也有分布。通過SNAP25和PSD95熒光染色圖像的疊加，，我們發(fā)現(xiàn)：在脊髓背角I/II板層，大多數(shù)SNAP25和突觸后PSD95呈現(xiàn)共分布 (圖3-1)。大多數(shù)呈點(diǎn)狀排列的SNAP25陽性物與PSD95相互重合或接近 (圖3-1)，提示：SNAP25可表達(dá)于脊髓背角淺層的突觸后神經(jīng)元。

圖3-2 SNAP23在脊髓背角的分布。左側(cè)圖依次顯示SNAP23、PSD95的免疫染色低倍采集圖像 (比例尺：100 μm)；最右側(cè)圖代表SNAP23 (紅光) 和PSD95 (綠光) 疊加后的高倍鏡采集圖像 (比例尺：20 μm)。3.2 脊髓背角SNARE復(fù)合物的組成為了進(jìn)一步鑒定與SNAP25可能形成復(fù)合物的其它SNARE成員及其輔助因子的種類，本實驗采用免疫共沉淀法，研究了SNAP25與syntaxins、VAMPs和Munc18s的相互作用。3.2.1 SNAP25與syntaxins的相互作用Syntaxins是一類參與胞吐作用的膜整合Q-SNARE蛋白家族，為了探討脊髓背角SNAP25和syntaxins (syntaxin1-4) 蛋白的相互作用。取正常成年大鼠，分離L4-L5脊髓節(jié)段，制備全細(xì)胞裂解液。將裂解液與anti-SNAP25的特異性抗體孵育，進(jìn)行免疫共沉淀，檢測沉降出的syntaxin1 (STX1)、syntaxin2 (STX2)、syntaxin3(STX3) 和syntaxin4 (STX4) 蛋白的相對含量，IgG作為陰性對照。結(jié)果顯示：Anti-SNAP25特異性抗體可不同程度地從脊髓背角裂解液中共沉
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2602430