【摘要】：目的乳腺癌是一種女性常發(fā)的腫瘤,近年來其發(fā)病率不斷上升,為公共健康帶來了極大威脅。研究表明,血管新生和免疫抑制在乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。因此,抗血管生成聯(lián)合免疫療法被認為是一種很有前景的乳腺癌治療策略。本研究以PEG-b-PGA為基本骨架構(gòu)建了具有銅離子螯合能力的嵌段聚合物RPTDH,通過疏水作用有效攜載Toll樣受體7/8(TLR7/8)特異性激動劑瑞喹莫德(R848),成功制備了一種具有pH敏感性與腫瘤主動靶向功能的納米載藥體系RPTDH/R848,從而將抗血管生成與免疫療法有效結(jié)合,以期實現(xiàn)對乳腺癌的協(xié)同治療作用。內(nèi)容本論文的研究內(nèi)容分為三部分。第一部分為納米載藥體系RPTDH/R848的制備與表征,主要包括RPTDH的合成與化學結(jié)構(gòu)的表征,RPTDH的銅離子螯合能力考察,RPTDH納米粒的制備及其pH敏感性的考察,RPTDH/R848納米粒子的制備及其載藥與釋藥性能的考察。第二部分為RPTDH/R848納米粒子的體外研究,主要包括細胞毒作用、免疫細胞激活、細胞遷移、侵襲及抗血管生成能力的考察及其抗血管生成機制的初步探討。第三部分為RPTDH/R848納米粒子的體內(nèi)研究,主要包括4T1乳腺癌原位小鼠腫瘤模型的構(gòu)建、RPTDH/R848納米粒子在小鼠體內(nèi)的組織分布和其抗腫瘤能力、抗血管生成及免疫激活作用的體內(nèi)評價。方法1.RPTDH/R848納米粒子的制備與表征:通過多步化學反應制備高分子銅螯合劑RPTDH,并利用傅里葉紅外光譜(FT-IR)、核磁共振氫譜(~1H NMR)與電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)對其進行化學結(jié)構(gòu)的表征與含硫量的檢測;利用凝膠滲透色譜(GPC)測定其分子量;通過紫外分光光譜(UV)及原子吸收光譜考察高分子材料RPTDH對Cu~(2+)的螯合能力;通過納米沉淀法制備RPTDH和RPTDH/R848納米粒子,并通過超高效液相色譜(UPLC)測定RPTDH/R848的載藥量和包封率;通過粒徑和Zeta電位分析儀檢測納米粒子的粒徑、粒徑分布和表面電荷性質(zhì);利用透射電子顯微鏡(TEM)測定納米粒子的形貌;通過~1H NMR、TEM和熒光芘探針法考察RPTDH納米粒子的pH響應性;通過動態(tài)透析法考察RPTDH/R848在不同pH釋放介質(zhì)中的體外藥物釋放特征。2.RPTDH/R848納米粒子的體外研究:通過MTT實驗檢測RPTDH和RPTDH/R848對人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC細胞、小鼠乳腺癌4T1細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞和人正常肺上皮BEAS-2B細胞的毒性作用;通過對HUVEC細胞進行Transwell、劃痕實驗和成管實驗,考察RPTDH/R848體外抗血管生成作用;RPTDH/R848納米�？寡苌勺饔玫臋C制探討:HUVEC細胞和MDA-MB-231細胞經(jīng)RPTDH/R848處理后,利用Western-blotting檢測核質(zhì)分離得到的細胞核和細胞質(zhì)蛋白中NF-κB的表達情況,通過激光共聚焦顯微鏡考察不同處理后NF-κB在HUVEC細胞和MDA-MB-231細胞中的亞細胞定位情況;采用ELISA試劑盒測定促血管新生因子白介素-1α(IL-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白介素-8(IL-8)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的分泌情況;通過實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測TNF-α、IFN-α、IL-6以及IL-12p40 mRNA的表達水平,通過流式檢測人漿細胞樣樹突狀細胞系CAL-1細胞表面CD80、CD86和CD83的表達情況,考察RPTDH/R848對CAL-1細胞的激活作用。3.RPTDH/R848納米粒子的體內(nèi)研究:通過將4T1-Luc細胞皮下種植于小鼠乳腺脂肪墊構(gòu)建乳腺癌轉(zhuǎn)移模型;IR780是一種近紅外熒光染料,可被包載入RPTDH制備RPTDH/IR780納米粒,利用小動物活體成像技術檢測RPTDH/IR780納米粒在肝、腎、脾、肺和腫瘤組織中的蓄積情況,綜合評價納米體系的腫瘤靶向性;尾靜脈注射RPTDH/R848納米粒,考察其體內(nèi)抗腫瘤作用;治療結(jié)束后,乳腺癌荷瘤小鼠腹腔注射熒光素酶底物,可通過活體成像系統(tǒng)考察乳腺癌肺部轉(zhuǎn)移情況;對治療后小鼠的肝、腎和脾進行病理學檢查,并利用免疫組化檢測腫瘤組織凋亡和抗血管生成情況,綜合評價RPTDH/R848納米粒子對乳腺癌的協(xié)同治療作用。結(jié)果1.成功合成并表征了高分子銅螯合劑RPTDH;~1H NMR、TEM和熒光芘探針結(jié)果顯示RPTDH納米粒子具有顯著的pH敏感性;利用納米沉淀法成功制備了RPTDH和RPTDH/R848納米粒,TEM結(jié)果顯示其呈規(guī)則球形結(jié)構(gòu);體外藥物釋放結(jié)果顯示,RPTDH/R848載藥納米體系中R848的釋放具有明顯的pH響應性。2.RPTDH/R848納米粒子可通過對Cu~(2+)的螯合實現(xiàn)對腫瘤細胞生長的抑制;RPTDH/R848通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位抑制促血管新生因子的分泌,從而降低HUVEC細胞的成管能力;RPTDH/R848可激活CAL-1細胞,引起細胞因子TNF-α、IFN-α、IL-6以及IL-12p40 mRNA表達升高,同時,CAL-1細胞表面CD80、CD86和CD83分子表達升高。3.成功構(gòu)建了小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型,經(jīng)尾靜脈注射RPTDH/IR780,24 h后,該納米體系主要分布于小鼠的腫瘤組織和肺部轉(zhuǎn)移灶,顯示出良好的體內(nèi)乳腺癌靶向作用;動物體內(nèi)實驗結(jié)果表明RPTDH/R848能聯(lián)合抗血管生成與免疫療法有效抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。結(jié)論本研究設計并成功構(gòu)建了一種具有腫瘤靶向性和pH-響應性的高分子納米載藥體系RPTDH/R848,該納米體系同時攜載了銅螯合劑與免疫激動劑R848,在體外實現(xiàn)了R848的pH-響應性釋放。在細胞水平,RPTDH/R848誘導的銅缺乏可調(diào)控NF-κB信號通路,進而抑制血管新生,同時RPTDH/R848可有效誘導人髓樣樹突狀CAL-1細胞的成熟與活化。在4T1-荷瘤小鼠體內(nèi),RPTDH納米粒子表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向性,并對體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用。綜上,RPTDH/R848納米粒子通過聯(lián)合抗血管生成與免疫療法實現(xiàn)了對乳腺癌的協(xié)同治療,為乳腺癌的臨床治療提供了新的策略。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文酸性條件下，具有 pH-響應性斷鍵性能的苯甲酰亞胺鍵發(fā)生斷裂，同時 PHis 發(fā)生疏水/親水性轉(zhuǎn)變，觸發(fā)納米粒解體并釋放 R848，進而激活 TLR7/8 信號通路介導的抗腫瘤免疫；斷裂的聚合物片段 γ-PGA-g-(TETA-DTC-PHis) 螯合腫瘤微環(huán)境中的 Cu2+，造成銅缺乏并阻斷腫瘤血管生成，進而抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。

圖 1.1 RPTDH 的合成路線RPC 的1H NMR 譜以及各特征質(zhì)子信號的歸屬如圖 1.2（A）所示。RPC 的1H NMR 譜圖中，PEG 的-CH2質(zhì)子峰出現(xiàn)在 3.50 ppm處，，4-CB 的苯環(huán)上的-CH質(zhì)子峰出現(xiàn)在 7.80 ppm處，4-CB 的-CHO 質(zhì)子峰出現(xiàn)在 9.88 ppm處，RGD 由于含 H 較少，因此特征質(zhì)子峰峰較弱。RPC 的紅外譜圖以及各特征峰的歸屬如圖 1.2（B）所示。RPC 的 IR 譜圖中，2876 cm-1處出現(xiàn)的峰是 C-H（PEG 的-CH2）的伸縮振動峰，1669.1 cm-1處出現(xiàn)的峰是 C-O 伸縮振動峰，1560.6 cm-1處出現(xiàn)的峰是 C=C 的伸縮振動峰，845.0 cm-1處出現(xiàn)的峰是 C-H 的彎曲振動峰。上述結(jié)果說明我們成功合成了 RPC。γ-PGA、BPT、PTDH 和 RPTDH 的1H NMR 波譜圖和 FT-IR 圖譜如圖 1.3所示。如圖 1.3（A）所示，1H NMR 譜圖中 γ-PGA、BPT、PTDH 和 RPTDH 的特征質(zhì)子峰清晰可見。如圖 1.3（B）所示，BPT 和 γ-PGA 相比，2950.4 cm-1歸屬于 TETA 中亞甲基的伸縮振動，1559.8 cm-1處的特征峰歸屬于 γ-PGA 與 TETA
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.9;R943

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本文編號：2599586