【摘要】：癌癥是現(xiàn)在醫(yī)學界的一個重大難題,針對癌癥的治療,目前主流的治療方法包括手術治療、放療、化療等方式,其中化療是最常用的治療方式之一。依托泊苷(Etoposide,ETO)是一種廣泛應用的拓撲異構(gòu)酶抑制劑類化療藥物,生物利用率較低及腫瘤細胞產(chǎn)生化療耐藥性是其應用中面臨的最大問題。開發(fā)ETO新劑型有助于提高其生物利用度,目前已報道的ETO新劑型包括混懸劑、脂質(zhì)體、微乳、亞微乳、納米乳、固體分散體、植入劑、微囊、微球等。聯(lián)合化療是指在一個化療療程中同時或者先后使用數(shù)種化療藥的一種用藥方式,其通過利用作用機制不同的化療藥物提高藥物對腫瘤細胞的殺傷率,進而提升抗腫瘤療效;此外,聯(lián)合化療可以去除耐藥因素,減少癌細胞產(chǎn)生耐藥的可能性。由于聯(lián)合化療的優(yōu)越性,目前單一用藥方案已經(jīng)被淘汰而成為歷史。亞微乳(Submicron emulsion,SE)是一類在表面活性劑和助表面活性劑的作用下,將油水兩相進行融合,粒徑在200nm以下的穩(wěn)定分散體系,是一種新型的載藥系統(tǒng),可以有效的提高藥物的生物利用度。近年來已有地西泮、兩性霉素B、卡馬西平等藥物的亞微乳制劑上市,使載藥亞微乳的研究無論在理論上還是實踐上都取得了重要進展。吐溫80是一種常用表面活性劑類藥用輔料,在亞微乳的制備過程中發(fā)揮著增溶,乳化等重要作用。但吐溫80的廣泛使用被報道可能引發(fā)過敏性及溶血性等不良反應,從而引發(fā)嚴重的藥品安全問題�；碧侵�(Sophorolipids,SLs)是一類目前報道的最具潛力的生物表面活性劑,主要分為酸型槐糖脂(Acidic sophorolipid,ASL)與內(nèi)酯型槐糖脂(Lactonic sophorolipid,LSL)兩類,其中ASL具有更好的發(fā)泡與乳化能力,LSL具有更好的抗腫瘤等生理活性。綜上,本研究首先探索和考察了ASL作為表面活性劑替代吐溫80在制備新型ETO亞微乳中的理論和實踐意義;隨后考察了LSL與ETO的聯(lián)合給藥的抗腫瘤效果及安全性。通過開展上述研究,探索槐糖脂分別作為表面活性劑類藥用輔料及抗腫瘤活性物質(zhì)方面的潛力,擴大槐糖脂的應用范圍。本文主要的研究內(nèi)容及研究結(jié)果如下:1.ETO亞微乳制備工藝的優(yōu)化及確定。優(yōu)化亞微乳制劑的處方及制備工藝,以酸型槐糖脂取代吐溫80制備依托泊苷亞微乳,得到最優(yōu)工藝如下:MCT:LCT=1:1為油相,1.8%卵磷脂,攪拌至溶解,然后與水相混合,800 bar,均質(zhì)8次,酸型槐糖脂的添加量為0.8 g/L。建立了依托泊苷亞微乳中依托泊苷的含量檢測方法,避免藥用輔料對出峰時間及出峰形狀的影響,同時優(yōu)化亞微乳制劑的表征方法,最終確定了2.5%的甘油溶液稀釋20倍作為表征條件,成功制備并表征了兩種亞微乳:酸型槐糖脂-依托泊苷亞微乳(ASL-ESE)和吐溫80-依托泊苷亞微乳(Tween-ESE)。2.ASL-ESE及Tween-ESE理化性質(zhì)的比較。以酸型槐糖脂和吐溫80為表面活性劑制備所得的兩種依托泊苷亞微乳為研究對象,檢測和比較了兩種亞微乳的粒徑、Zeta電位、多分散系數(shù)(PDI)以及pH,載藥量,包封率等指標。實驗結(jié)果顯示:ASL-ESE粒徑為197.73nm,PDI為0.051,Zeta電位為-41.40mV,包封率為95.95%;Tween-ESE的粒徑為195.8nm,PDI為0.167,Zeta電位為-43.47mV,包封率為93.01%,表明ASL-ESE在粒徑分布和載藥量方面均明顯優(yōu)于Tween-ESE,其中載藥量提高了112.6%。利用透射電鏡觀察亞微乳的形態(tài)并考察了其體外釋放特性。體外釋放實驗結(jié)果表明兩種ETO亞微乳的體外釋放特性均優(yōu)于傳統(tǒng)ETO注射液,且ASL-ESE的體外釋放特性優(yōu)于Tween-ESE。3.ASL-ESE及Tween-ESE體外抗腫瘤活性的比較。兩種亞微乳制劑的體外抗腫瘤試驗結(jié)果表明:亞微乳制劑中的輔料對于細胞的毒性較小;亞微乳劑型相對于傳統(tǒng)ETO注射液,具有明顯的細胞增殖抑制作用。40μg/mL的ASL-ESE對卵巢癌A2780細胞的抑制率為78%,而同等濃度下,Tween-ESE的抑制率僅為36.64%。ASL-ESE的IC_(50)僅為12.77μg/mL,遠低于ETO注射液的158.35μg/mL,也低于Tween-ESE的84.8μg/mL。使用流式細胞儀檢測了不同亞微乳對卵巢癌A2780細胞凋亡的影響。結(jié)果表明亞微乳制劑通過誘導細胞凋亡達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。其中,對照組的卵巢癌A2780活細胞比例為94.04%,凋亡率為5.87%。與對照組相比,ETO注射液處理組的卵巢癌A2780活細胞為59.33%,凋亡率為37.8%;Tween-ESE組的卵巢癌A2780活細胞為46.47%,凋亡率為52.1%;而ASL-ESE組的卵巢癌A2780活細胞僅為1.29%,凋亡率達到95.58%。此外,對所得ETO亞微乳進行了安全性評價,結(jié)果表明亞微乳制劑的安全性良好,無血管刺激性和過敏現(xiàn)象出現(xiàn),也未產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。4.LSL與ETO聯(lián)合用藥的體外抗腫瘤活性及機制研究。首先考察了LSL對乳腺癌MCF-7,鼠源乳腺癌4T1,卵巢癌A2780,鼻咽癌CEN-28,黑色素瘤B-16,胃癌SGC-7901的體外抗腫瘤活性。結(jié)果顯示:LSL對卵巢癌A2870的抑制效果最好,IC_(50)僅為30.34μg/mL;對乳腺癌4T1細胞的抑制增殖作用也較好,IC_(50)為36.17μg/mL。因此后續(xù)研究主要以卵巢癌細胞A2780及乳腺癌細胞4T1為研究對象。MTT法測定聯(lián)合給藥抗腫瘤效果的試驗結(jié)果表明:對于卵巢癌A2780細胞,LSL的加入可以大幅降低藥物的IC_(50)。當LSL:ETO為1:1時,IC_(50)僅為95.36μg/mL,相比于ETO單獨給藥,IC_(50)降低了30.21%。對于乳腺癌4T1,LSL:ETO分別為0:4,1:3,2:2,3:1,4:0時,對應的IC_(50)為93.36μg/mL,74.49μg/mL,53.65μg/mL,38.56μg/mL,36.17μg/mL。綜合考慮后,選擇LSL:ETO為1:1為后續(xù)試驗中的最佳給藥比例。利用DAPI染色觀察兩種癌細胞株給藥后細胞核的形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)兩種癌細胞的細胞核染色質(zhì)有明顯的皺縮,甚至出現(xiàn)細胞核破碎現(xiàn)象。流式細胞術證實了針對于本研究所選的兩種癌細胞株,聯(lián)合給藥都具有一定的協(xié)同作用。其中對卵巢癌A2780,依托泊苷單獨使用時,細胞凋亡率僅為8.06%;LSL 40μg/mL的給藥濃度單獨給藥時,細胞凋亡率為到15.01%;而聯(lián)合給藥時凋亡率達到了23.95%。對乳腺癌4T1,依托泊苷單獨使用時,細胞存活率達到83.5%;LSL 40μg/mL的給藥濃度單獨給藥時,細胞存活率為84.0%;而聯(lián)合給藥時細胞存活率降低至80.8%。聯(lián)合給藥組相對于單獨給藥可以提高依托泊苷的藥效,并且是通過誘導凋亡的方式來抑制癌細胞。5.LSL與ETO聯(lián)合用藥的體內(nèi)抗腫瘤活性研究。將鼠源乳腺癌細胞4T1細胞按每只小鼠右側(cè)腋下皮下注射1*10~6-1*10~7個活細胞,注射量0.1mL。接種后,每天觀察小鼠生理狀態(tài)及腋下成瘤情況。取荷瘤小鼠36只,分為模型組,依托泊苷組,內(nèi)酯型槐糖脂組,低劑量聯(lián)合給藥組,中劑量聯(lián)合給藥組,高劑量聯(lián)合給藥組6組。每組6只。在觀察成瘤后進行分組給藥,采用灌胃給藥的方式,給藥量為0.2mL,連續(xù)給藥7天。結(jié)果顯示:無論是小鼠的平均體重還是小鼠的體重增長率,依托泊苷組均為最低,而Qg酯型槐糖脂給藥組與聯(lián)合給藥組的小鼠的體重無明顯變化。與模型組相比,依托泊苷組的抑制率最低為19.45%(p0.001)。聯(lián)合給藥組的腫瘤抑制率均高于單獨給藥組,高劑量聯(lián)合給藥組抑制效果最好,抑瘤率達到75.38%(p0.001)。
【圖文】：
依托泊苷分子結(jié)構(gòu)式
合肥工業(yè)大學碩士學位論文會的進步與發(fā)展及人們環(huán)保意識的增強，，生物表面活性劑替代劑將成為必然趨勢，具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)意義。表面根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可以把生物表面活性劑分為脂肽類和脂蛋白類和脂肪酸類、中性脂類、顆粒生物表面活性劑以及多聚物生的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)
【學位授予單位】：合肥工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R943;R96
【參考文獻】
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本文編號：
2599330
