【摘要】：背景熱休克反應(yīng)(heat shock response,HSR)是生物體在外界某些刺激(如高熱、氧化應(yīng)激和重金屬等)下,為維持自身穩(wěn)態(tài)而激活熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)表達(dá)的保護(hù)反應(yīng)。高表達(dá)的HSPs(如Hsp70,Hsp40等)通過幫助其它蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)或降解以防止蛋白質(zhì)發(fā)生變性后在細(xì)胞內(nèi)大量堆積從而破壞細(xì)胞自身的穩(wěn)態(tài)。多項研究表明,熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(Heat shock transcription factor 1,HSF1)在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),并與腫瘤的演進(jìn)和不良預(yù)后密切相關(guān),主要作用機(jī)制是通過增強(qiáng)其自身326位點的絲氨酸(S326)進(jìn)行磷酸化,從而上調(diào)Hsp70、Hsp27等的表達(dá)后促進(jìn)其下游靶基因c-myc,Ras,c-fos等的激活,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性增殖和凋亡抵抗。大量證據(jù)表明HSF1可作為一個很好的抗腫瘤靶點。近期研究表明HSF1調(diào)控HSP轉(zhuǎn)錄表達(dá)的同時也受HSP的反饋調(diào)節(jié)。其相對分子機(jī)制目前尚不完全清楚。其中廣為研究的為Hsp70。熱休克蛋白70是一種高度保守且普遍表達(dá)的HSPs家族,幾乎存在于所有生物體中,受HSF1調(diào)控作用最強(qiáng)。應(yīng)激誘導(dǎo)的Hsp70(由三個非常密切相關(guān)的旁系同源物編碼:HSPA1A、HSPA1B和HSPA1L)屬于Hsp70家族的成員之一。細(xì)胞可以通過響應(yīng)高熱、過氧化和pH值變化等應(yīng)激條件而活化HSF1,進(jìn)而誘導(dǎo)Hsp70高水平表達(dá),進(jìn)而維護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定,降低細(xì)胞內(nèi)蛋白毒性壓力。已有研究指出HSF1的轉(zhuǎn)錄活性主要受HspA1A的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。異硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)是一種天然存在十字花科蔬菜中的異硫氰酸酯。PEITC已被研究用于預(yù)防多種癌癥,此外還在神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和細(xì)菌感染發(fā)炎等方面發(fā)揮著保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)PEITC可以激活多種細(xì)胞保護(hù)途徑,如由HSF1介導(dǎo)的熱休克反應(yīng),并可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的變化。因此,我們設(shè)計并合成針對HSPA1A基因的gRNA(guide RNA),轉(zhuǎn)染細(xì)胞后引導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶在HSPA1A基因組的特定位點進(jìn)行酶切,在HSPA1A基因外顯子的ATG前定點引入GFP的核酸序列,使得GFP基因的轉(zhuǎn)錄水平受控于HSPA1A啟動子的活性;GFP核酸序列末尾的終止密碼子TAA使得HSPA1A的翻譯被阻斷。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,經(jīng)抗生素加壓篩選和流式細(xì)胞術(shù)分離,測序鑒定得到HSPA1A~(-/-)/GFP的重組單克隆細(xì)胞系,以此重組細(xì)胞為模型進(jìn)行篩選調(diào)控HSF1/Hsp70的藥物。鑒于HSF1與腫瘤的耐藥、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。系統(tǒng)、精準(zhǔn)地篩選調(diào)控?zé)嵝菘朔磻?yīng)的藥物就變得尤為重要。本課題旨在豐富能調(diào)控HSF1的化合物庫并完善相關(guān)的分子機(jī)制研究。目的利用CRISSPR/Cas9基因編輯技術(shù)在宮頸癌細(xì)胞(Hela)的HSPA1A基因外顯子的ATG前定點引入GFP的核酸序列。使得GFP基因的轉(zhuǎn)錄水平受控于HSPA1A啟動子的活性,通過在GFP編碼基因的3'末端添加終止密碼子TAA使HSPA1A的翻譯被提前阻斷。以重組細(xì)胞Hela/HSPA1A~(-/-)/GFP為模型篩選調(diào)控?zé)嵝菘朔磻?yīng)的藥物并探索相關(guān)調(diào)控機(jī)制。方法和結(jié)果1.構(gòu)建靶向人HSPA1A基因的CRISPR/Cas9 PX333-gRNA質(zhì)粒和HSPA1A~(-/-)/GFP重組片段質(zhì)粒。為提高gRNA的切割效率,我們在HSPA1A基因的起始密碼子上下游各設(shè)計了2個gRNA位點。2.將質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系(Hela),通過高速流式細(xì)胞分選系統(tǒng)(FACS)篩選得到熒光重組單克隆細(xì)胞,通過PCR,WB和FACS在DNA水平、蛋白水平、細(xì)胞水平驗證基因重組結(jié)果。3.通過WB和FACS意外發(fā)現(xiàn)PEITC與熱休克處理沒有協(xié)同作用,PEITC反而拮抗由熱休克介導(dǎo)的應(yīng)激作用。4.通過核質(zhì)分離,三聚體實驗和CHIP檢測PEITC處理下HSF1的轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)。結(jié)果顯示PEITC增強(qiáng)HSF1在熱應(yīng)激期間的活化水平。5.為了排除敲除HSPA1A對PEITC處理3~#重組細(xì)胞結(jié)果的影響,在同樣處理條件下處理Hela細(xì)胞后進(jìn)行核質(zhì)分離,WB和RT-PCR結(jié)果比較。結(jié)果顯示HspA1A反饋調(diào)節(jié)HSF1磷酸化狀態(tài)。6.RNA免疫共沉淀(RIP)實驗發(fā)現(xiàn)并證明HSF1能直接結(jié)合Hsp70的mRNA進(jìn)行翻譯調(diào)控;免疫共沉淀(Co-IP)實驗發(fā)現(xiàn)并證明HSF1參與調(diào)控應(yīng)激狀態(tài)下核糖體的組裝;PEITC影響HSF1在應(yīng)激狀態(tài)下與mRNA或核糖體的相互作用。結(jié)論P(yáng)EITC是HSF1的激活劑;PEITC使HSF1在熱應(yīng)激期間持續(xù)活化并抑制下游靶蛋白的翻譯;HspA1A負(fù)反饋調(diào)節(jié)HSF1的磷酸化狀態(tài),與HSF1共同參與調(diào)控應(yīng)激狀態(tài)下核糖體的組裝及對Hsp70 mRNA的翻譯。
【圖文】：

圖 2.1 構(gòu)建 PX333-HSPA1A-gRNA 表達(dá)質(zhì)粒及 HSPA1A-/-/GFP 重組片段質(zhì)粒。A: HSPA1A 重組基因結(jié)構(gòu)模式圖；B：Px333-gRNA 質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，從左向右依次為： 質(zhì)�？蛰d Px333 質(zhì)粒 Bbs I酶切成單鏈，電泳時遷移速度變慢；而連入 gRNA 后單酶切位點被破壞，因此與原質(zhì)粒遷移速度相同。gRNA 與 Px333 質(zhì)粒成功酶連致使 Bbs I 酶切位點喪失；而空載仍會被酶切。C：HSPA1A-/-/GFP 同源重組片段的基因結(jié)構(gòu)模式圖。D: HSPA1A-/-/GFP 同源重組片段質(zhì)粒的雙酶切驗證的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2.2 獲得 Hela/HSPA1A-/-/GFP 重組單克隆細(xì)胞系將 PX333-HSPA1A-gRNA 質(zhì)粒，HSPA1A-/-/GFP 同源重組片段和 pBABE 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞，經(jīng)過 10 μg/ml 嘌呤霉素加壓篩選三天后，，富集三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染均陽性的細(xì)胞。43 ℃熱休克處理 1 h，恢復(fù)正常培養(yǎng) 10 h 后通過高速流式細(xì)胞分選系統(tǒng)分選出GFP 熒光表達(dá)陽性的單細(xì)胞，將單細(xì)胞大量擴(kuò)大培養(yǎng)。先凍一批細(xì)胞進(jìn)行保種，再提取單克隆細(xì)胞的基因組 DNA 和總 mRNA，通過基因組測序和 RT-PCR 驗證得到兩株在

2.實驗結(jié)果Western Blot 的結(jié)果進(jìn)一步證明，3#和 4#細(xì)胞株在熱休克（43℃，1h）處理，應(yīng)用Hsp90 的特異抑制劑 17AAG（0.2 μM/L）或蛋白酶體抑制劑 MG132（5 μM/L）處理后，受 HSF1 調(diào)控的 HSPs 的蛋白表達(dá)均顯著增多，其中 GFP 和 Hsp70 的表達(dá)水平劇烈升高，并且隨 17AAG的刺激呈時間依賴性上調(diào)（2.2 圖 C）；與 Western Blot 的結(jié)果一致，Real time PCR的檢測結(jié)果顯示，相同條件的熱休克或 MG132處理后，3#和 4#細(xì)胞中 GFP 和 Hsp70 的 mRNA 的表達(dá)水平均顯著升高。17AAG（0.2 μM/L）刺激 12h后，GFP 的 mRNA 水平達(dá)到峰值（2.2 圖 D）。這些結(jié)果證明 3#和 4#細(xì)胞的 GFP 的基因和蛋白表達(dá)均與 HSF1 的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)；3#和 4#重組細(xì)胞能對不同的應(yīng)激條件做出應(yīng)答，表明重組細(xì)胞系的熱休克應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)能正常工作。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 萬思敏;CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Hsf4導(dǎo)致晶狀體細(xì)胞衰老的機(jī)制研究[D];河南大學(xué);2017年

本文編號：2598941