【摘要】：研究背景:2,4’,5’-三羥基-5,2’-二溴二苯甲酮(LM49)是課題組在對(duì)海藻多酚類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化的過程中,得到的新型多酚結(jié)構(gòu)化合物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)LM49可明顯改善急性腎盂腎炎大鼠的腎功能,增加大鼠血清中的抗炎因子IL-10的含量,降低炎癥因子IL-1β和IL-6的含量,表明了LM49對(duì)細(xì)菌性炎癥具有抗炎作用。但是,具體的抗炎機(jī)制尚不明確,RAW264.7細(xì)胞為體外研究炎癥反應(yīng)的靶細(xì)胞,因此本文主要探討LM49對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的影響,從而明確LM49發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制。目的:鑒于巨噬細(xì)胞的極化參與機(jī)體調(diào)控炎癥反應(yīng)的進(jìn)程,本課題旨在探討LM49抗炎活性與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系,且通過體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)LM49對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響,并初步探討LM49調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制。方法:第一部分多酚化合物L(fēng)M49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞極化的影響1.MTT法檢測(cè)LM49對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。2.Griess法檢測(cè)LM49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌NO產(chǎn)量的影響。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LM49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞膜表面分子CD16/32和CD206表達(dá)的影響。4.Western-blot檢測(cè)LM49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌i NOS和Arg-1蛋白表達(dá)的影響。5.RT-PCR檢測(cè)LM49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞Arg-1、i NOS、CD206、CD86、CD163、FIZZ、IL-6、TNF-α、IL-10、MCP-1和IL-12 m RNA表達(dá)的影響。第二部分LM49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞極化機(jī)制的初步探討1.RT-PCR檢測(cè)LM49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IRF-4、IRF-5、KLF4、SOCS1、SOCS3、NF-κB、STAT1、STAT3、STAT6、TLR4、Myd88、JAK1、JAK2和JAK3 m RNA表達(dá)的影響。2.Western-blot檢測(cè)LM49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4、Myd88和NF-κB蛋白表達(dá)的影響。3.Western-blot檢測(cè)LM49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞SOCS1、JAK2、p-JAK2、STAT1和p-STAT1蛋白表達(dá)的影響。4.Western-blot檢測(cè)LM49對(duì)LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞JAK1、p-JAK1、JAK3、p-JAK3、STAT6和p-STAT6蛋白表達(dá)的影響。第三部分LM49對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷中肝臟Kuffer細(xì)胞極化的影響1.微孔法檢測(cè)LM49對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清中的AST和ALT活力的影響,ELISA檢測(cè)小鼠血清中的IL-6和TNF-α含量的影響。HE染色檢測(cè)LM49對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的肝臟組織炎癥反應(yīng)的影響。2.免疫組化檢測(cè)LM49對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織中Arg-1的表達(dá)影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟巨噬細(xì)胞(KCs)中CD16/32和CD206的表達(dá)。3.Western-blot和RT-PCR檢測(cè)LM49對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的KCs細(xì)胞中i NOS和Arg-1表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1.LM49在0~30μmol·L-1濃度下對(duì)RAW264.7細(xì)胞無明顯毒性,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇的劑量為5μmol·L-1,10μmol·L-1,20μmol·L-1。LM49呈劑量依賴性的抑制LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清液中NO的表達(dá)。LM49顯著抑制i NOS的蛋白表達(dá)和誘導(dǎo)Arg-1的蛋白表達(dá),且呈一定的劑量依賴性。2.LM49抑制LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞M1型標(biāo)志物CD16/32的表達(dá)和誘導(dǎo)M2型標(biāo)志物CD206的表達(dá),且呈劑量依賴性;LM49抑制LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中i NOS、IL-6、TNF-α、CD86、MCP-1和IL-12的m RNA表達(dá),誘導(dǎo)Arg-1、CD206、CD163、FIZZ和IL-10 m RNA的表達(dá)。3.LM49抑制LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IRF-5、JAK2、SOCS3、STAT1、TLR4、Myd88和NF-κB m RNA的表達(dá),上調(diào)細(xì)胞中IRF-4、KLF4、SOCS1、JAK1、JAK3和STAT6 m RNA的表達(dá),但是,對(duì)STAT3 m RNA的表達(dá)沒有明顯的促進(jìn)作用。4.LM49抑制LPS+INF-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TLR4、Myd88和NF-κB蛋白的表達(dá);LM49的高劑量組顯著增加細(xì)胞中SOCS1的表達(dá),抑制細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT1和p-STAT1蛋白的表達(dá);LM49上調(diào)RAW264.7細(xì)胞中JAK1、p-JAK1、JAK3、p-JAK3、STAT6和p-STAT6蛋白的表達(dá)。5.LM49可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清中的AST和ALT的活性,對(duì)血清中的炎癥因子IL-6和TNF-α也有顯著的抑制作用。病理切片顯示,LM49可明顯減少LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟中炎性細(xì)胞浸潤。6.免疫組化結(jié)果顯示,LM49可以顯著性增加肝臟中M2標(biāo)志物Arg-1的表達(dá);流式結(jié)果顯示,LM49可以顯著性的增加M2標(biāo)志物F4/80+CD206+細(xì)胞數(shù)目,減少了M1標(biāo)志物F4/80+CD16/32+細(xì)胞數(shù)目;RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示,LM49可以顯著增加肝臟KCs細(xì)胞中Arg-1的表達(dá),降低了KCs細(xì)胞中i NOS的表達(dá)。結(jié)論:1.LM49對(duì)LPS聯(lián)合INF-γ誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞有顯著的抑制作用,同時(shí)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。2.LM49通過對(duì)TLR4-Myd88-NF-κB和JAK2-STAT1通路的負(fù)向調(diào)控作用抑制M1型巨噬細(xì)胞極化;通過對(duì)JAK1/JAK3-STAT6通路的正向調(diào)控作用促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。3.LM49對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠具有肝臟保護(hù)作用,可能通過其促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞向M2型極化發(fā)揮其抗炎作用。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ X±SD）來表示。采用 graphpad p驗(yàn)及 One-way ANOVA 比較各組內(nèi)及組間差異。P <義。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行 3 次。2 結(jié) 果 RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力的影響 所示，，LM49 作用于 RAW264.7 細(xì)胞 24 h 后，在 0～264.7 細(xì)胞無明顯毒性。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，LM49 的

LPS+INF-γ誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞上清液中 NO 的含量的影響 control 組（##P < 0.01），LM49 組 vs LPS/INF-γ組（*P < 0.0 LPS+INF-γ誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞膜表面分達(dá)的影響所示，LPS+INF-γ組與空白組比，可顯著誘導(dǎo) RAW；而 LM49 組與 LPS+INF-γ組相比，可顯著抑制 L胞中 CD16/32 的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo) RAW264.7 中 CD2量依賴性。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2598909