【摘要】：神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子,具有促進神經(jīng)元胞體存活、軸突定向再生和髓鞘生成的作用。目前,國際上通用的NGF活性測定方法主要有雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法和大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細胞株(PC12細胞)培養(yǎng)法兩種。傳統(tǒng)的雞胚背根神經(jīng)節(jié)法比較經(jīng)典,但方法操作比較繁瑣,檢測結(jié)果易受實驗操作人員主觀判斷的影響,只能用作定性和半定量評價。PC12細胞培養(yǎng)法是基于NGF對PC12細胞分化的誘導(dǎo)作用。PC12細胞膜上有NGF受體,受生理水平NGF的誘導(dǎo),PC12細胞停止分裂,長出神經(jīng)突起,分化成具有交感神經(jīng)元特性的細胞。分化的PC12細胞量與NGF活性間具有一定線性關(guān)系,可用于評價NGF的活性。 本論文的目的是建立并優(yōu)化用PC12細胞測定NGF活性的檢測方法。主要包括：(1)PC12細胞培養(yǎng)方法的優(yōu)化。包括NGF的稀釋倍數(shù)、細胞的接種密度、細胞懸液的清洗次數(shù)、細胞的培養(yǎng)時間、染色液的染色時間。實驗結(jié)果表明：在無血清培養(yǎng)條件下,NGF倍比稀釋,最佳細胞接種密度為(3-4)*104／孔,最佳清洗次數(shù)為2次,最佳培養(yǎng)時間為48h,最佳染色時間為4h。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)方法分別測定了兩個不同生產(chǎn)批次的NGF生物活性,變異系數(shù)均小于15%。(2)方法學(xué)驗證。對優(yōu)化后的PC12細胞培養(yǎng)法進行了方法學(xué)驗證,包括方法準確性、精密度、線性測定范圍、抗干擾能力等�？垢蓴_能力主要考察輔料甘露醇和人血白蛋白對NGF活性的影響。實驗結(jié)果表明,本論文建立的改良PC12細胞培養(yǎng)法用于注射用鼠NGF活性分析,方法抗干擾能力強,輔料對NGF活性測定沒有明顯影響；方法準確度與精密度良好,回收率為80%-120%,變異系數(shù)10%；線性測定范圍較寬1-100AU/ml,線性回歸方程為：y=-0.873/[1+(x/17.977)2.092]+1.350。對多批次武漢海特生產(chǎn)的注射用鼠NGF活性測定結(jié)果表明,所建立的方法實用性良好。
【圖文】：

培養(yǎng)時間為48h,染色時間為4h,考察細胞接種密度對PC12細胞檢測NGF活性方法的影響。不同細胞密度下所測得的吸光值如表5所示，四參數(shù)曲線擬合如圖5所示，檢測結(jié)果顯示：細胞濃度在2xl05/ml時所的的標準曲線相關(guān)系數(shù)好，曲線平滑，各點分布均勻，曲線更為典型，故細胞濃度選擇2xl05/ml來進行活性測定。表5不同細胞接種密度下的吸光值NGF劑量 細胞1X1 OVml 細胞2x 1 oVml 細胞3x 1 oVmlAU/ml 平均吸光值 平均吸光值 平均吸光值200 1.109 1.385 1.396100 1.098 1.377 1.33350 0.981 1.239 1.31225 0.548 0.981 1.02312.5 0.318 0.548 0.7816.25 0.254 0.318 0.5703.125 0.219 0.211 0.4941.5625 0.109 0.201 0.3120.7813 0.065 0.198 0.16522

細胞180^11，培養(yǎng)時間為48h，，染色時間為4h,考察細胞清洗次數(shù)對PC12細胞檢測NGF活性方法的影響。不同清洗次數(shù)下所測得的吸光值如表6所示，四參數(shù)曲線擬合如圖6所示，檢測結(jié)果顯示：清洗2次和3次，其相關(guān)系數(shù)都達標，但是細胞清洗3次的細胞狀態(tài)不及清洗2次的狀態(tài)好，所得的標準曲線信噪比較差，故對細胞清洗2次作為實驗條件的確立。表6不同細胞清洗次數(shù)下的吸光值NGF劑量AU/ml 細胞清洗2次平均吸光值 細胞清洗3次平均吸光值24
【學(xué)位授予單位】：湖北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R927.1

【參考文獻】

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本文編號：2597744