【摘要】：神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,具有促進(jìn)神經(jīng)元胞體存活、軸突定向再生和髓鞘生成的作用。目前,國(guó)際上通用的NGF活性測(cè)定方法主要有雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法和大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株(PC12細(xì)胞)培養(yǎng)法兩種。傳統(tǒng)的雞胚背根神經(jīng)節(jié)法比較經(jīng)典,但方法操作比較繁瑣,檢測(cè)結(jié)果易受實(shí)驗(yàn)操作人員主觀判斷的影響,只能用作定性和半定量評(píng)價(jià)。PC12細(xì)胞培養(yǎng)法是基于NGF對(duì)PC12細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用。PC12細(xì)胞膜上有NGF受體,受生理水平NGF的誘導(dǎo),PC12細(xì)胞停止分裂,長(zhǎng)出神經(jīng)突起,分化成具有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞。分化的PC12細(xì)胞量與NGF活性間具有一定線性關(guān)系,可用于評(píng)價(jià)NGF的活性。 本論文的目的是建立并優(yōu)化用PC12細(xì)胞測(cè)定NGF活性的檢測(cè)方法。主要包括：(1)PC12細(xì)胞培養(yǎng)方法的優(yōu)化。包括NGF的稀釋倍數(shù)、細(xì)胞的接種密度、細(xì)胞懸液的清洗次數(shù)、細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間、染色液的染色時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在無血清培養(yǎng)條件下,NGF倍比稀釋,最佳細(xì)胞接種密度為(3-4)*104／孔,最佳清洗次數(shù)為2次,最佳培養(yǎng)時(shí)間為48h,最佳染色時(shí)間為4h。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)方法分別測(cè)定了兩個(gè)不同生產(chǎn)批次的NGF生物活性,變異系數(shù)均小于15%。(2)方法學(xué)驗(yàn)證。對(duì)優(yōu)化后的PC12細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,包括方法準(zhǔn)確性、精密度、線性測(cè)定范圍、抗干擾能力等�？垢蓴_能力主要考察輔料甘露醇和人血白蛋白對(duì)NGF活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本論文建立的改良PC12細(xì)胞培養(yǎng)法用于注射用鼠NGF活性分析,方法抗干擾能力強(qiáng),輔料對(duì)NGF活性測(cè)定沒有明顯影響；方法準(zhǔn)確度與精密度良好,回收率為80%-120%,變異系數(shù)10%；線性測(cè)定范圍較寬1-100AU/ml,線性回歸方程為：y=-0.873/[1+(x/17.977)2.092]+1.350。對(duì)多批次武漢海特生產(chǎn)的注射用鼠NGF活性測(cè)定結(jié)果表明,所建立的方法實(shí)用性良好。
【圖文】：

培養(yǎng)時(shí)間為48h,染色時(shí)間為4h,考察細(xì)胞接種密度對(duì)PC12細(xì)胞檢測(cè)NGF活性方法的影響。不同細(xì)胞密度下所測(cè)得的吸光值如表5所示，四參數(shù)曲線擬合如圖5所示，檢測(cè)結(jié)果顯示：細(xì)胞濃度在2xl05/ml時(shí)所的的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)好，曲線平滑，各點(diǎn)分布均勻，曲線更為典型，故細(xì)胞濃度選擇2xl05/ml來進(jìn)行活性測(cè)定。表5不同細(xì)胞接種密度下的吸光值NGF劑量 細(xì)胞1X1 OVml 細(xì)胞2x 1 oVml 細(xì)胞3x 1 oVmlAU/ml 平均吸光值 平均吸光值 平均吸光值200 1.109 1.385 1.396100 1.098 1.377 1.33350 0.981 1.239 1.31225 0.548 0.981 1.02312.5 0.318 0.548 0.7816.25 0.254 0.318 0.5703.125 0.219 0.211 0.4941.5625 0.109 0.201 0.3120.7813 0.065 0.198 0.16522

細(xì)胞180^11，培養(yǎng)時(shí)間為48h，，染色時(shí)間為4h,考察細(xì)胞清洗次數(shù)對(duì)PC12細(xì)胞檢測(cè)NGF活性方法的影響。不同清洗次數(shù)下所測(cè)得的吸光值如表6所示，四參數(shù)曲線擬合如圖6所示，檢測(cè)結(jié)果顯示：清洗2次和3次，其相關(guān)系數(shù)都達(dá)標(biāo)，但是細(xì)胞清洗3次的細(xì)胞狀態(tài)不及清洗2次的狀態(tài)好，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線信噪比較差，故對(duì)細(xì)胞清洗2次作為實(shí)驗(yàn)條件的確立。表6不同細(xì)胞清洗次數(shù)下的吸光值NGF劑量AU/ml 細(xì)胞清洗2次平均吸光值 細(xì)胞清洗3次平均吸光值24
【學(xué)位授予單位】：湖北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R927.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2597744