【摘要】：誘因復(fù)雜的心力衰竭(Heart failure,HF)是心臟疾病發(fā)展的終末階段,其中藥物源性導(dǎo)致的心力衰竭占有一定比例。由于心臟器官的重要性、不可再生和難以修復(fù)的特征,規(guī)避藥物對心臟損傷的新藥研究,以及保護(hù)心臟的藥物開發(fā)一直是藥物設(shè)計的重要工作。研究室前期通過國際合作研究,發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白10(Bone morphogenetic proteins 10,BMP10)具有促進(jìn)和調(diào)節(jié)心臟組織的胚胎發(fā)育和出生后的生長發(fā)育作用。本文通過生物制備獲得高活性的重組人BMP10(recombinant human BMP10,rhBMP10),通過體內(nèi)功能研究評價了rhBMP10對藥物源性心力衰竭發(fā)生的保護(hù)作用,主要結(jié)果如下:(1)構(gòu)建rhBMP10表達(dá)質(zhì)粒,并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞中,獲得穩(wěn)定高表達(dá)rhBMP10的CHO-BMP10單克隆細(xì)胞株。將human BMP10 cDNA序列中的EcoRI酶切位點(diǎn)(GAATTC)同義突變?yōu)镚AGTTC,并插入至pMH3質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。用電轉(zhuǎn)染的方式獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-BMP10細(xì)胞,并使用Dot blot和Western blot驗(yàn)證了CHO-BMP10單克隆細(xì)胞株可以穩(wěn)定表達(dá)rhBMP10。篩選獲得的CHO-BMP10單克隆細(xì)胞株具備了作為本文后續(xù)研究工作中的起始出發(fā)細(xì)胞的要求。(2)將CHO-BMP10細(xì)胞株懸浮馴化,進(jìn)行批次流加培養(yǎng),使用Q柱和分子篩對培養(yǎng)上清進(jìn)行純化,獲取純化的rhBMP10并進(jìn)行體外活性檢測。懸浮馴化~10 d后,懸浮培養(yǎng)的CHO-BMP10細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)24 h倍增。在批次流加培養(yǎng)中,CHO-BMP10細(xì)胞的最大密度達(dá)到9.1×10~6 cells/mL,培養(yǎng)結(jié)束時,rhBMP10在培養(yǎng)上清中的累積濃度為35.3 mg/L。純化后所獲得的rhBMP10純度達(dá)到95%以上,收率為49.8%。對純化所得的rhBMP10的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析,考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果包括~116 kDa、~68 kDa、~43kDa和~26 kDa四個條帶,分別為全長二聚體、部分切割二聚體、前導(dǎo)肽單體和生長因子結(jié)構(gòu)域二聚體。驗(yàn)證了使用Furin體外酶切以獲得N端一致的生長因子結(jié)構(gòu)域二聚體的可行性。利用從Id1基因中分離的一組BRE序列(BMP responsive element,BRE),構(gòu)建了能夠特異性響應(yīng)BMP10刺激的pGL6-BRE-Luc質(zhì)粒,并驗(yàn)證了我們所表達(dá)的rhBMP10具有較高的生物活性。通過批次流加培養(yǎng)和兩段式控溫,使得高生物活性的rhBMP10在培養(yǎng)上清中大量積累,為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供必要的材料。(3)利用多柔比星(Doxorubicin,DOX)構(gòu)建了小鼠心力衰竭模型,并對其造成的心臟功能和器質(zhì)性變化進(jìn)行檢查。DOX模型小鼠的射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction,EF)為73.1±3.8%,顯著低于對照組的84.6±2.4%和rhBMP10處理組的82.6±5.6%。DOX模型小鼠心臟組織切片的Masson’s染色出現(xiàn)了心肌纖維化的組織,同時最小肌纖維直徑為11.3μm,而DOX+rhBMP10聯(lián)合給藥組的心肌組織未見大面積纖維組織,最小肌纖維直徑為12.3μm。DOX模型小鼠心肌組織中cPARP水平較對照組和DOX+rhBMP10聯(lián)合給藥組明顯升高。TUNEL檢測中心肌細(xì)胞凋亡比例達(dá)到0.196%,顯著高于對照組中的0.014%和DOX+rhBMP10聯(lián)合給藥組中的0.036%。此外,DOX模型小鼠的血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶、cTroponin I和Myoglobin水平較對照組和DOX+rhBMP10聯(lián)合給藥組顯著升高。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示,與線粒體功能相關(guān)的Ppargc1a、Esrra、Sdha和Nudfa3等基因的轉(zhuǎn)錄水平在DOX模型小鼠的心肌組織中出現(xiàn)了明顯下調(diào),而DOX+rhBMP10聯(lián)合給藥組中上述基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于DOX模型小鼠。上述結(jié)果顯示,rhBMP10能夠減輕由DOX引起的心臟功能和器質(zhì)性損傷。本研究構(gòu)建了編碼human BMP10 cDNA的pMH3質(zhì)粒,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞中,篩選獲得了穩(wěn)定高表達(dá)rhBMP10的CHO-BMP10細(xì)胞株。通過3 L搖瓶批次流加培養(yǎng)累積產(chǎn)物,并探索了rhBMP10的純化條件,分析了其結(jié)構(gòu)特征。通過高劑量多次DOX注射構(gòu)建了DOX誘導(dǎo)的小鼠心臟病模型,并使用超聲心動圖、Masson’s染色、實(shí)時熒光定量PCR、Western blot和TUNEL等方法證明rhBMP10在減輕DOX引起的心臟損傷方面的積極作用。
【圖文】：

底面后室溫?fù)u床孵育 15min，待細(xì)胞完全裂解后，將裂解物吸出，移至 置于-80℃?zhèn)溆�；取白�?96 孔板，每孔加入 30 μL 裂解物，用排槍向每孔加入 80 μL LA標(biāo)儀測定發(fā)光值（1 s）；取出孔板，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。物分組以及 DOX 心肌損傷小鼠模型的建立雄性健康 C57 小鼠隨機(jī)分為 4 組，其中兩組每組 15 只（Saline 組，，rhB余兩組每組 20 只（DOX 組，DOX+rhBMP10 組）。在實(shí)驗(yàn)開始前 3 天，X 每天注射 PBS 200 μL；rhBMP10 組和 DOX + rhBMP10 組每天注射 2（2 μg），直至第五周結(jié)束。Saline 組和 rhBMP10 組每周注射一次 PBS 組和 DOX + rhBMP10 組每周注射一次 DOX（5 mg/kg），共 5 次。第五隨機(jī)選取 6 只動物檢測超聲心動圖；隨后處死動物，分離血清檢測心肌酶抽提 RNA 進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR 分析轉(zhuǎn)錄水平差異；抽提蛋白進(jìn)行 W蛋白水平差異；組織切片 Masson·s 染色觀察纖維化情況；TUNEL 檢測凋

將突變位點(diǎn)兩邊的片段擴(kuò)增并電泳割膠回收（圖3-1-A）。將回收產(chǎn)物和兩端引物（FL-5·和 FL-3·）一起進(jìn)行 PCR，15cycles 后制樣電泳，凝膠在紫外下可見一條清晰的目的條帶和一條模糊的非特異性條帶（圖 3-1-B）。將位于~1,300 bp 的目的條帶切膠回收后，再用兩端引物進(jìn)行擴(kuò)增，可在~1,300 bp 位置得到一條清晰的目的條帶（圖 3-1-C）。使用 EcoRI 和 NotI 限制性內(nèi)切酶在 37℃酶切后，進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠在紫外下可見位于~8,000bp 的線性化空載質(zhì)粒，以及位于~1,300 bp 的原裝載片段（圖 3-1-D）。將 PCR 擴(kuò)增所得目的片段用 EcoRI 和 NotI限制性內(nèi)切酶在 37℃酶切以獲得黏性末端，與酶切后的線性化空載質(zhì)粒在 22℃使用 T4Ligase 連接 30min 后
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R915;R96

【相似文獻(xiàn)】

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1 王若璋;重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白10（rhBMP10）的表達(dá)純化和活性評價[D];江南大學(xué);2019年

本文編號：2597327