發(fā)布時間：2020-03-23 07:23

【摘要】：研究背景及目的心肌重構(gòu)是慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的主要病理生理過程,是許多嚴(yán)重心血管疾病發(fā)展為心力衰竭的最后共同通路。盡管目前治療心血管疾病的藥物和手段有多種,死亡率有所下降,但心源性猝死的比重卻持續(xù)增加。心肌重構(gòu)包括結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu),其中心肌電重構(gòu)引起的離子通道電流異常是誘發(fā)惡性心律失常及心源性猝死的主要原因。闡明心肌電重構(gòu)的細(xì)胞與分子機(jī)制,對于發(fā)現(xiàn)電重構(gòu)的潛在治療靶標(biāo),以及控制惡性室性心律失常的發(fā)生意義重大。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它參與心肌重構(gòu)的多個方面,GSK-3β是重要的心肌肥厚負(fù)性調(diào)節(jié)信號分子,對心肌細(xì)胞凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用,而且在血管組織中能促進(jìn)血管增生,由于它具有一定的促凋亡能力,因而也可以作為提高缺血后心肌存活率的治療靶點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn),GSK-3β對多種離子通道有作用,但是這些文獻(xiàn)主要集中于GSK-3β對神經(jīng)細(xì)胞離子通道的作用,而其對心肌細(xì)胞中離子通道的影響未見有報道,并且它在心肌電重構(gòu)有著怎樣的作用也未見闡明。本課題擬建立大鼠心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型和大鼠心肌細(xì)胞系H9C2缺氧模型,觀察GSK-3β抑制劑SB216763對心肌梗死大鼠心肌組織、心臟功能和QT間期的影響,篩選GSK-3β參與調(diào)節(jié)的離子通道,并進(jìn)一步通過大鼠H9C2心肌細(xì)胞缺氧模型對篩選通道進(jìn)行驗(yàn)證。為解釋心肌損傷后心肌電重構(gòu)的分子機(jī)制以及心律失常的防治提供新思路和新靶點(diǎn)。研究方法1.大鼠心肌梗死模型的建立:采用冠狀動脈左前降支(LAD)結(jié)扎術(shù)建立急性心肌梗死模型,手術(shù)全程心電監(jiān)護(hù),手術(shù)后II導(dǎo)聯(lián)有ST段明顯的抬高,則模型建立成功。2.分組和給藥:雄性8周齡SD大鼠平均分為3組(2天組每組各10只,7天組每組各11只):假手術(shù)組(Sham),手術(shù)組(MI),給藥組(MI+SB)(術(shù)前1小時,GSK-3β抑制劑SB216763,尾靜脈注射給藥,0.6 mg·kg~(-1)·d~(-1),在2天組中,每24h后給一次藥,2天后處死;在7天組中,每24h后給一次藥,連續(xù)給藥7天后處死);Sham組只手術(shù)不結(jié)扎,MI+SB組同MI組處置方法。3.觀察SB216763對大鼠心肌梗死的影響:采用HE染色、Masson染色、心電圖、超聲心動圖、血清心肌酶的方法檢測SB216763對大鼠心臟組織形態(tài)、纖維化、心功能以及QT間期的影響,并采用qPCR方法對影響QT間期的離子通道進(jìn)行篩選,進(jìn)一步采用qPCR和Western blot的方法對篩選出來的離子通道在mRNA和蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證。4.觀察SB216763對缺氧H9C2細(xì)胞活性和鉀離子通道表達(dá)的影響:使用Research Science AW400TG細(xì)胞工作站建立細(xì)胞缺氧模型。分組和給藥:H9C2分為7組:NC(正常)、缺氧組(6h、12h、24h)、SB216763預(yù)處理組(SB/6h、SB/12h、SB/24h)。預(yù)處理組均采用10μM GSK-3β抑制劑SB216763預(yù)處理1h后再進(jìn)行缺氧的方法處理,根據(jù)所篩選出的12h時間點(diǎn)檢測SB216763對Kir2.1的蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果1.GSK-3β抑制劑SB216763對大鼠心肌梗死后心肌組織形態(tài)和纖維化的保護(hù)作用HE染色結(jié)果顯示,MI組細(xì)胞有空泡化和炎性浸潤發(fā)生,7天的程度較2天更加明顯,所對應(yīng)的同期的MI+SB組均可以降低細(xì)胞損傷的惡性程度。術(shù)后Masson染色結(jié)果可見,術(shù)后組2天和7天MI組膠原纖維增生,比Sham組的纖維化程度明顯加重,(P0.001,P0.01),所對應(yīng)的MI+SB組較MI組皆有所減輕(P0.01,P0.05)。2.GSK-3β抑制劑SB216763減輕大鼠心肌梗死后心功能的損傷與Sham組相比,MI組在心梗后2天心臟功能受到損害,LVEF和LVFS顯著降低(LVEF:P0.01,LVFS:P0.01),同MI組相比,MI+SB組改善了LVEF和LVFS的不良后果(LVEF:P0.05,LVFS:P0.01)。與Sham組相比,MI組在心梗后7天心臟功能受到損害(LVEF:P0.001,LVFS:P0.01),同MI組相比,MI+SB組改善了LVEF和LVFS的不良后果(LVEF:P0.05,LVFS:P0.05)。3.GSK-3β抑制劑SB216763減少大鼠心肌梗死后血清LDH、cTn-I的水平術(shù)后2天的動物血清中,MI組的心肌酶LDH顯著升高,cTn-I無顯著升高(LDH:P0.001,cTn-I:P0.05),同MI組相比,MI+SB組LDH顯著降低,cTn-I無顯著降低(LDH:P0.001,cTn-I:P0.05)。術(shù)后7天的動物血清中,同Sham組相比,MI組心肌酶LDH、cTn-I顯著升高(LDH:P0.001,cTn-I:P0.001),而MI+SB組LDH、cTn-I比MI組顯著降低(LDH:P0.001,cTn-I:P0.001)。4.GSK-3β抑制劑SB216763縮短大鼠心肌梗死后心電圖的QT間期心電圖儀Ⅱ?qū)?lián)測量三組大鼠手術(shù)前、手術(shù)后和處死前三個時間點(diǎn)的心電圖,并計算心率(heart rate,HR)、QT間期和QTc。術(shù)前各組之間HR、QT、QTc并未明顯差異,術(shù)后MI組出現(xiàn)異常波形,ST端抬高,表明心肌梗死手術(shù)模型造模成功;術(shù)后2天和7天的結(jié)果均顯示,MI組和Sham組相比,HR加快,QT、QTc均明顯延長,MI+SB組和MI組相比,HR減慢,QT和QTc均縮短。5.GSK-3β抑制劑SB216763對心肌梗死大鼠Kir2.1 mRNA(KCNJ2)和蛋白表達(dá)水平的降低具有上調(diào)作用在大鼠心肌梗死后2天和7天檢測各組動物心肌組織缺血區(qū)SCN 5A(Nav1.5)、KCND2(Kv4.2)、CACNA1C(Cav1.2)、KCNQ1(K_V7.1)、hERG(K_V11.1)、KCNJ2(Kir2.1)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,心肌梗死后,SCN 5A(Nav1.5)、KCND2(Kv4.2)、KCNQ1(K_V7.1)、hERG(K_V11.1)、KCNJ2(Kir2.1)mRNA表達(dá)水平下降,采用B216763預(yù)處理后,MI大鼠心肌組織中KCNJ2的表達(dá)上調(diào),其余離子通道的mRNA水平無顯著變化(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,同Sham組相比,MI組Kir2.1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.01),MI+SB組同MI組相比,Kir2.1表達(dá)升高(P0.05)。6.10μM SB216763對H9C2細(xì)胞活性的影響用10μM濃度的GSK-3β抑制劑SB216763作用于H9C2細(xì)胞培養(yǎng)不同時間后,結(jié)果顯示,同NC組相比,在此濃度下的SB216763對H9C2細(xì)胞培養(yǎng)6h、12h、24h、48h不同時間點(diǎn)的細(xì)胞活性沒有影響。7.GSK-3β抑制劑SB216763減少缺氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞后cTn-I的釋放量細(xì)胞分組處理后,收集細(xì)胞上清進(jìn)行cTn-I檢測,同NC相比,缺氧6h、12h、24h的H9C2細(xì)胞cTn-I釋放顯著增加,分別為(P0.01,P0.01,P0.001),抑制劑組在12h時能夠顯著降低cTn-I的釋放(P0.01)。8.GSK-3β抑制劑SB216763能減弱缺氧H9C2細(xì)胞Kir2.1蛋白的降低同NC組相比,在缺氧12h之后,Kir2.1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.01),SB216763預(yù)處理之后,Kir2.1蛋白表達(dá)上調(diào)(P0.05);結(jié)論1.GSK-3β抑制劑SB216763能緩解大鼠心肌梗死后心功能損傷;2.GSK-3β抑制劑SB216763能上調(diào)大鼠心肌梗死后鉀離子通道KCNJ2/Kir2.1的mRNA和蛋白水平的表達(dá);3.在H9C2細(xì)胞水平,GSK-3β抑制劑SB216763對缺氧12h誘導(dǎo)的鉀離子通道Kir2.1的表達(dá)降低具有上調(diào)作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R965

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本文編號：2596399