發(fā)布時間：2020-03-23 00:17

【摘要】：目的(1)基于分子對接實驗考察橙皮苷(Hesperidin,HP)與法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)之間的相互作用;(2)在體外及體內(nèi)水平,基于FXR探究橙皮苷對膽汁淤積的治療作用及機制。方法(1)使用Glide軟件包中對FXR和橙皮苷進(jìn)行分子對接,考察橙皮苷與FXR受體之間的相互作用。(2)采用橙皮苷干預(yù)正常HepaRG細(xì)胞及Si-FXR沉默細(xì)胞,兩種細(xì)胞的分組及處理方式相同,具體如下:(1)對照(Control)組:含0.2%DMSO的無血清培養(yǎng)基;(2)橙皮苷(HP)組:含12.5 umol/L橙皮苷的無血清培養(yǎng)基;(3)膽酸鹽干預(yù)(BAs)組:含50倍正常人血清中膽酸鹽水平的無血清培養(yǎng)基;(4)橙皮苷與膽酸鹽混合干預(yù)(HP+BAs)組:含50倍正常人血清中膽酸鹽與12.5 umol/L橙皮苷的無血清培養(yǎng)基;(5)奧貝膽酸與膽酸鹽混合干預(yù)(OCA+BAs)組:含50倍正常人血清中膽酸鹽與2 umol/L奧貝膽酸的無血清培養(yǎng)基,每組干預(yù)時間均為24 h。測定總膽汁酸(TBA)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量及HE和F-actin免疫熒光染色考察各組細(xì)胞形態(tài)變化,并考察轉(zhuǎn)運體鈉離子/�；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白(Na~+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)、膽鹽外排泵(bile salt export pump,BSEP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein2,MRP2)、有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽1B1(organic anion-transporting polypeptides1B1,OATP1B1),細(xì)胞色素P450酶系7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)以及核受體FXR的mRNA表達(dá)。(3)C57BL/6J雄性小鼠70只,體重18-25 g,隨機分為7組,每組10只。具體分組及處理如下:(1)對照(Control)組:灌胃給予溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉溶液);(2)單給橙皮苷(HP)組:灌胃給予橙皮苷100 mg/kg;(3)模型(ANIT)組:灌胃給予溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉溶液);(4)低劑量橙皮苷治療(HP 25mg/kg+ANIT)組:灌胃給予橙皮苷25 mg/kg;(5)中劑量橙皮苷治療(HP 50mg/kg+ANIT)組:灌胃給予橙皮苷50 mg/kg;(6)高劑量橙皮苷治療(HP 100mg/kg+ANIT)組:灌胃給予橙皮苷100 mg/kg;(7)奧貝膽酸治療(OCA 10mg/kg+ANIT)組:灌胃給予奧貝膽酸10 mg/kg。上述各組均每天給藥一次,連續(xù)7天,并在實驗第5天,除Control組和HP組灌胃給予等量的溶媒(植物油)外其余各組小鼠均單次灌胃給予α-異硫氰酸酯(ANIT)75 mg/kg。于實驗第7天各組灌胃給予相應(yīng)藥物后,禁食4 h,摘單側(cè)眼球取血,頸椎脫臼處死。摘取膽囊,采集肝臟和十二指腸。測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBIL)、堿性磷酸化酶(ALP)和γ-谷氨�；D(zhuǎn)移酶(γ-GT)水平及不同組織TBA含量;肝臟部分組織采用HE染色進(jìn)行病理學(xué)評價,部分采用RT-qPCR技術(shù)考察轉(zhuǎn)運體Ntcp、Bsep、Mrp2和Oatp1a1、代謝酶Cyp7a1和Cyp27a1及核受體Fxr和小異二聚體伴侶(small heterodimer partner,Shp)的mRNA表達(dá)。結(jié)果(1)分子對接結(jié)果顯示,橙皮苷和FXR受體的對接打分為-9.443 Kcal/mol,該得分介于FXR受體最優(yōu)激動劑得分-13.985 Kcal/mol和已知的FXR激動劑OCA得分-9.057 Kcal/mol之間,并且橙皮苷和FXR對接時的氫鍵、疏水作用以及橙皮苷在FXR受體催化結(jié)構(gòu)域中的結(jié)合作用均表明橙皮苷與FXR受體的結(jié)合作用方式利于受體蛋白功能的實現(xiàn)。(2)細(xì)胞實驗結(jié)果顯示,與BAs組相比,HP+BAs組HepaRG細(xì)胞生存率顯著提高(p0.01),TBA水平顯著降低(p0.05),SiFXR+HP+BAs組的AST水平顯著上升(p0.05)。但HE與肌動蛋白(F-actin)染色結(jié)果顯示各組細(xì)胞形態(tài)均無明顯差異。相較于BAs組,HP+BAs組NTCP與CYP7A1的表達(dá)均顯著降低(p0.05),MRP2與FXR的表達(dá)均顯著升高(p0.05),BSEP的表達(dá)有上升趨勢,但無顯著差異(p0.05)。(3)動物實驗結(jié)果顯示,與ANIT組相比,100 mg/kg HP+ANIT組的肝重與膽重指數(shù)均顯著降低(p0.05),100 mg/kg HP+ANIT組的AST、ALT、TBIL與ALP均顯著下降(p0.05)。各劑量HP+ANIT組中血清、肝臟和膽囊中TBA水平相較于ANIT組均顯著下降(p0.01),十二指腸中TBA水平較ANIT組具有上升趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異。各劑量HP+ANIT組肝臟組織病理學(xué)變化較ANIT組有所改善。在RT-qPCR實驗結(jié)果中,與ANIT組相比,50 mg/kg HP+ANIT組的Ntcp顯著降低(p0.05);100 mg/kg HP+ANIT組的Oatp1a1顯著升高(p0.05);HP 50 mg/kg+ANIT組及HP 100 mg/kg+ANIT組Bsep和Mrp2的表達(dá)均顯著升高(p0.01);各劑量HP+ANIT組Cyp7a1及Cyp27a1的表達(dá)均顯著降低(p0.05),Fxr與Shp的表達(dá)均顯著升高(p0.05)。結(jié)論(1)在分子對接實驗中,橙皮苷分子能夠通過ARG264和HIE447兩個氫鍵與FXR受體進(jìn)行牢固對接,并且與FXR激動劑OCA的對接分?jǐn)?shù)相近,推測橙皮苷具有激動FXR的作用。(2)細(xì)胞實驗結(jié)果表明,給予12.5 umol/L橙皮苷干預(yù)HepaRG細(xì)胞24 h后,能明顯緩解細(xì)胞內(nèi)膽酸鹽的蓄積毒性;將HepaRG細(xì)胞FXR沉默后,發(fā)現(xiàn)橙皮苷的作用消失,推測其減毒機制可能與激動FXR有關(guān)。(3)動物研究結(jié)果表明,不同劑量的橙皮苷對ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積小鼠具有治療作用,其中高劑量橙皮苷治療組作用最為顯著,且與OCA療效接近,其治療機制可能與橙皮苷激動Fxr受體,進(jìn)而調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

圖 1-1 膽酸鹽肝腸循環(huán)[5]Fig 1-1 The enterohepatic circulation of bile acid salt.2 膽酸鹽對肝細(xì)胞的損傷機制膽酸鹽結(jié)構(gòu)中極性基團(tuán)的數(shù)量、位置和構(gòu)型以及側(cè)鏈與甘氨酸或�；撬岬孽䴓O大地影響 BAs 的疏水性，是決定膽酸鹽毒性大小的重要因素[15]。具有羥基的膽汁酸通常更疏水，反之亦然。有文獻(xiàn)報道，疏水性膽酸鹽如 CDCA 和 LCA 在肝細(xì)胞中的蓄積是造成膽汁淤積型肝損傷的主要原因之一6]。此外，疏水性膽汁酸已被確定為導(dǎo)致結(jié)腸癌和肝癌的重要致病因子[15]表明，疏水性膽酸鹽可通過破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，最能導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[13]。另有研究認(rèn)為，疏水性膽酸鹽會使得肝細(xì)胞膨脹腫細(xì)胞內(nèi)膽紅素大量蓄積，，同時也會對線粒體功能造成一定影響，并最終對肝造成損傷[17,18]。（1）膽酸鹽誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機制：細(xì)胞內(nèi)一定濃度的膽酸鹽可通過誘導(dǎo)細(xì)胞而最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。疏水性膽酸鹽能夠激活或增加死亡受體 Fas 蛋白的表

化合物橙皮苷的對接構(gòu)象的 2D 圖（圖片由 MAESs representing the docked conformation of compoundcaptured by MAESTRO）在 FXR 催化結(jié)構(gòu)域中的結(jié)合作用（PYMOL 可視
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2595848