【摘要】：目的:1.探討自噬在亞砷酸鈉(NaAsO_2)誘導大鼠胰島素瘤(INS-1)細胞死亡過程中的作用及分子機制;2.探討α-硫辛酸(α-LA)對NaAsO_2致INS-1細胞自噬性死亡過程的保護作用及分子機制。方法:1.NaAsO_2誘導INS-1細胞自噬性死亡研究實驗:以INS-1細胞為研究對象,實驗設空白對照(Ctrl)組,不同濃度NaAsO_2組(120、60、30、15、5μmol/L),(1)采用CCK8法檢測不同濃度NaAsO_2作用INS-1細胞24 h后INS-1細胞的增殖抑制率,根據CCK8實驗結果,采用NaAsO_2(30、15、5μmol/L)三個濃度為染砷濃度進行后續(xù)實驗研究。(2)通過透射電子顯微鏡觀察INS-1細胞超微結構;(3)通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察轉染質粒GFP-LC3后INS-1細胞內熒光的表達;(4)設空白對照組、NaAsO_2組(30、15、5μmol/L)、自噬抑制劑氯喹組(CQ,10μmol/L)、CQ與NaAsO_2合用組(CQ+NaAsO_2 30μmol/L)作用INS-1細胞24 h后采用Western-Blot法檢測自噬相關蛋白LC3、P62、Beclin-1、mTOR、PI3K、AKT的表達。2.α-LA對NaAsO_2致INS-1細胞自噬性死亡過程的保護作用實驗研究:以INS-1細胞為研究對象,根據實驗1結果選擇NaAsO_2濃度30μmol/L建立INS-1細胞自噬損傷模型,實驗設空白對照組、模型組(NaAsO_2 30μmol/L)組及α-LA(200、100、50μmol/L)預處理組,預處理時間為用NaAsO_2造模前3h,按分組處理INS-1細胞24h后。(1)采用CCK8比色法檢測INS-1細胞的增殖抑制率;(2)通過透射電子顯微鏡觀察INS-1細胞超微結構;(3)通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察轉染質粒GFP-LC3后INS-1細胞內熒光的表達;(4)通過Western-Blot法檢測自噬相關蛋白LC3、P62、Beclin-1、mTOR、PI3K、AKT的表達。結果:1.NaAsO_2誘導INS-1細胞自噬性死亡研究實驗結果:(1)NaAsO_2能夠明顯抑制INS-1細胞的增殖,經NaAsO_2作用24 h后的IC50為23.28μmol/L。(2)通過透射電鏡觀察NaAsO_2組INS-1細胞中可見雙層膜自噬小體與自噬空泡生成。(3)轉染質粒GFP-LC3后NaAsO_2組激光掃描共聚焦顯微鏡下可見INS-1細胞中綠色點狀熒光聚集增多。(4)Western-Blot檢測結果表明與空白對照組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(0.89±0.04)、P62(0.50±0.04)、Beclin-1(2.00±0.09)、mTOR(1.48±0.04)、PI3K(1.41±0.02)、AKT(1.38±0.04)比較,30、15、5μmol/L Na As O2組INS-1細胞中LC-3Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達分別為(1.36±0.02、1.12±0.02、1.09±0.04)增多,P62蛋白表達分別為(2.78±0.03、2.71±0.06、1.14±0.11)增多,Beclin-1蛋白表達分別為(1.36±0.07、1.47±0.05、1.87±0.06)減少,m TOR蛋白表達分別為(0.69±0.04、0.82±0.02、0.89±0.08)減少,PI3K蛋白表達分別為(0.61±0.04、0.70±0.03、0.89±0.05)減少,AKT蛋白表達分別為(0.94±0.01、1.43±0.06、1.43±0.04)減少,除Na As O2 5μmol/L組LC3、Beclin-1蛋白及15、5μmol/L組AKT蛋白表達無統(tǒng)計學差異外,其余差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);與空白對照組比較10μmol/L CQ處理組INS-1細胞中P62蛋白表達(0.96±0.06)增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(1.03±0.07),Beclin-1蛋白表達(2.17±0.08),m TOR蛋白表達(1.14±0.09),PI3K蛋白表達(1.39±0.06,AKT蛋白表達(1.36±0.04),均無統(tǒng)計學差異。與30μmol/L Na As O2組比較,CQ與Na As O2合用組INS-1細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達[(1.22±0.02)]減少,P62蛋白表達(3.00±0.02)增多,Beclin-1蛋白表達(1.74±0.01)增多,m TOR蛋白表達(1.07±0.04)增多,PI3K蛋白表達(1.08±0.06)減少,AKT蛋白表達(1.16±0.05)增多,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.α-LA對Na As O2誘導INS-1細胞自噬性死亡過程的保護作用實驗研究(1)經Na As O2作用后,INS-1細胞增殖抑制率明顯上升,細胞活性降低;給予α-LA預處理后INS-1細胞增殖抑制率下降,細胞活性增加。(2)透射電鏡下Na As O2組INS-1細胞中可見明顯雙層膜自噬小體與自噬空泡生成,α-LA各預處理組INS-1細胞中未見明顯自噬小體和自噬空泡生成。(3)轉染質粒GFP-LC3后,激光掃描共聚焦顯微鏡下Na As O2組可見明顯綠色點狀熒光斑點聚集,α-LA各預處理組未見明顯熒光斑點聚集。(4)Western-Blot檢測結果表明:與空白對照組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(2.10±0.10)、P62(0.26±0.05)、Beclin-1(1.35±0.05)、m TOR(1.12±0.07)、PI3K[(0.88±0.05)、AKT(0.97±0.05)比較,30μmol/L Na As O2組INS-1細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(3.94±0.14)增多,P62蛋白表達(0.97±0.03)增多,Beclin-1蛋白表達(1.02±0.02)減少,m TOR蛋白表達(0.77±0.03)減少,PI3K蛋白表達(0.54±0.02)減少,AKT蛋白表達(0.68±0.01)減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);與30μmol/L Na As O2組比較,200、100、50μmol/Lα-LA預處理組INS-1細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達分別為(1.77±0.12、2.65±0.08、2.63±0.15)減少,P62蛋白表達分別為(0.64±0.03、0.61±0.03、0.68±0.02)減少,Beclin-1蛋白表達分別為(1.25±0.04、1.26±0.04、1.08±0.02)增多,m TOR蛋白表達分別為(1.15±0.08、1.39±0.05、0.90±0.01)增多,PI3K蛋白表達分別為(0.89±0.07、0.79±0.05、0.59±0.03)增多,AKT蛋白表達分別為(1.18±0.05、1.16±0.03、0.79±0.01)增多,除50μmol/Lα-LA預處理組Beclin-1蛋白表達無統(tǒng)計學意義外,其余差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.Na As O2可誘導INS-1細胞自噬性死亡,其機制可能與調控PI3K/AKT-m TOR信號通路有關。2.α-LA可能通過介導PI3K/AKT-m TOR信號通路對Na As O2誘導的INS-1細胞自噬性死亡發(fā)揮保護作用。
【圖文】：

計數板計算細胞個數，，以時間天（d）為橫坐標，以活細曲線，結果表明：細胞接種后第 1 d 細胞數量開始增加，在長期，第 3~5 d 細胞生長開始平臺期，第 6 d 細胞數目顯微鏡下可見培養(yǎng)瓶內細胞碎片增多。由此可知 INS-1 細開始對數生長期，可用于實驗（見圖 2-1）。NaAsO2誘導 INS-1 細胞死亡過程中的作用研究胞生長曲線的測定

表 2-1 NaAsO2對 INS-1 細胞增殖抑制率（%）的影響（ x ±s，n=3）Table. 2-1 Effect of NaAsO2on proliferation inhibition rate (%) of INS-1 cells ( x ±s，n=3組別 濃度（μmol/L） OD 值 增殖抑制率（%）空白對照組 - 1.41±0.01 -NaAsO2組 120 0.10±0.01*92.71±0.6560 0.28±0.05*80.09±3.2230 0.70±0.03*50.50±2.3115 0.94±0.02*33.30±2.155 1.24±0.04*11.68±1.80注: 與空白對照組比較，*表示 P ＜0. 05。
【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R965

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本文編號：2591376