【摘要】：目的:1.探討自噬在亞砷酸鈉(NaAsO_2)誘導(dǎo)大鼠胰島素瘤(INS-1)細(xì)胞死亡過(guò)程中的作用及分子機(jī)制;2.探討α-硫辛酸(α-LA)對(duì)NaAsO_2致INS-1細(xì)胞自噬性死亡過(guò)程的保護(hù)作用及分子機(jī)制。方法:1.NaAsO_2誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞自噬性死亡研究實(shí)驗(yàn):以INS-1細(xì)胞為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照(Ctrl)組,不同濃度NaAsO_2組(120、60、30、15、5μmol/L),(1)采用CCK8法檢測(cè)不同濃度NaAsO_2作用INS-1細(xì)胞24 h后INS-1細(xì)胞的增殖抑制率,根據(jù)CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用NaAsO_2(30、15、5μmol/L)三個(gè)濃度為染砷濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。(2)通過(guò)透射電子顯微鏡觀察INS-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);(3)通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3后INS-1細(xì)胞內(nèi)熒光的表達(dá);(4)設(shè)空白對(duì)照組、NaAsO_2組(30、15、5μmol/L)、自噬抑制劑氯喹組(CQ,10μmol/L)、CQ與NaAsO_2合用組(CQ+NaAsO_2 30μmol/L)作用INS-1細(xì)胞24 h后采用Western-Blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、P62、Beclin-1、mTOR、PI3K、AKT的表達(dá)。2.α-LA對(duì)NaAsO_2致INS-1細(xì)胞自噬性死亡過(guò)程的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究:以INS-1細(xì)胞為研究對(duì)象,根據(jù)實(shí)驗(yàn)1結(jié)果選擇NaAsO_2濃度30μmol/L建立INS-1細(xì)胞自噬損傷模型,實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、模型組(NaAsO_2 30μmol/L)組及α-LA(200、100、50μmol/L)預(yù)處理組,預(yù)處理時(shí)間為用NaAsO_2造模前3h,按分組處理INS-1細(xì)胞24h后。(1)采用CCK8比色法檢測(cè)INS-1細(xì)胞的增殖抑制率;(2)通過(guò)透射電子顯微鏡觀察INS-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);(3)通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3后INS-1細(xì)胞內(nèi)熒光的表達(dá);(4)通過(guò)Western-Blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、P62、Beclin-1、mTOR、PI3K、AKT的表達(dá)。結(jié)果:1.NaAsO_2誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞自噬性死亡研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)NaAsO_2能夠明顯抑制INS-1細(xì)胞的增殖,經(jīng)NaAsO_2作用24 h后的IC50為23.28μmol/L。(2)通過(guò)透射電鏡觀察NaAsO_2組INS-1細(xì)胞中可見(jiàn)雙層膜自噬小體與自噬空泡生成。(3)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3后NaAsO_2組激光掃描共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)INS-1細(xì)胞中綠色點(diǎn)狀熒光聚集增多。(4)Western-Blot檢測(cè)結(jié)果表明與空白對(duì)照組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(0.89±0.04)、P62(0.50±0.04)、Beclin-1(2.00±0.09)、mTOR(1.48±0.04)、PI3K(1.41±0.02)、AKT(1.38±0.04)比較,30、15、5μmol/L Na As O2組INS-1細(xì)胞中LC-3Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)分別為(1.36±0.02、1.12±0.02、1.09±0.04)增多,P62蛋白表達(dá)分別為(2.78±0.03、2.71±0.06、1.14±0.11)增多,Beclin-1蛋白表達(dá)分別為(1.36±0.07、1.47±0.05、1.87±0.06)減少,m TOR蛋白表達(dá)分別為(0.69±0.04、0.82±0.02、0.89±0.08)減少,PI3K蛋白表達(dá)分別為(0.61±0.04、0.70±0.03、0.89±0.05)減少,AKT蛋白表達(dá)分別為(0.94±0.01、1.43±0.06、1.43±0.04)減少,除Na As O2 5μmol/L組LC3、Beclin-1蛋白及15、5μmol/L組AKT蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,其余差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與空白對(duì)照組比較10μmol/L CQ處理組INS-1細(xì)胞中P62蛋白表達(dá)(0.96±0.06)增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)(1.03±0.07),Beclin-1蛋白表達(dá)(2.17±0.08),m TOR蛋白表達(dá)(1.14±0.09),PI3K蛋白表達(dá)(1.39±0.06,AKT蛋白表達(dá)(1.36±0.04),均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與30μmol/L Na As O2組比較,CQ與Na As O2合用組INS-1細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)[(1.22±0.02)]減少,P62蛋白表達(dá)(3.00±0.02)增多,Beclin-1蛋白表達(dá)(1.74±0.01)增多,m TOR蛋白表達(dá)(1.07±0.04)增多,PI3K蛋白表達(dá)(1.08±0.06)減少,AKT蛋白表達(dá)(1.16±0.05)增多,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.α-LA對(duì)Na As O2誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞自噬性死亡過(guò)程的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究(1)經(jīng)Na As O2作用后,INS-1細(xì)胞增殖抑制率明顯上升,細(xì)胞活性降低;給予α-LA預(yù)處理后INS-1細(xì)胞增殖抑制率下降,細(xì)胞活性增加。(2)透射電鏡下Na As O2組INS-1細(xì)胞中可見(jiàn)明顯雙層膜自噬小體與自噬空泡生成,α-LA各預(yù)處理組INS-1細(xì)胞中未見(jiàn)明顯自噬小體和自噬空泡生成。(3)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3后,激光掃描共聚焦顯微鏡下Na As O2組可見(jiàn)明顯綠色點(diǎn)狀熒光斑點(diǎn)聚集,α-LA各預(yù)處理組未見(jiàn)明顯熒光斑點(diǎn)聚集。(4)Western-Blot檢測(cè)結(jié)果表明:與空白對(duì)照組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(2.10±0.10)、P62(0.26±0.05)、Beclin-1(1.35±0.05)、m TOR(1.12±0.07)、PI3K[(0.88±0.05)、AKT(0.97±0.05)比較,30μmol/L Na As O2組INS-1細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)(3.94±0.14)增多,P62蛋白表達(dá)(0.97±0.03)增多,Beclin-1蛋白表達(dá)(1.02±0.02)減少,m TOR蛋白表達(dá)(0.77±0.03)減少,PI3K蛋白表達(dá)(0.54±0.02)減少,AKT蛋白表達(dá)(0.68±0.01)減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與30μmol/L Na As O2組比較,200、100、50μmol/Lα-LA預(yù)處理組INS-1細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)分別為(1.77±0.12、2.65±0.08、2.63±0.15)減少,P62蛋白表達(dá)分別為(0.64±0.03、0.61±0.03、0.68±0.02)減少,Beclin-1蛋白表達(dá)分別為(1.25±0.04、1.26±0.04、1.08±0.02)增多,m TOR蛋白表達(dá)分別為(1.15±0.08、1.39±0.05、0.90±0.01)增多,PI3K蛋白表達(dá)分別為(0.89±0.07、0.79±0.05、0.59±0.03)增多,AKT蛋白表達(dá)分別為(1.18±0.05、1.16±0.03、0.79±0.01)增多,除50μmol/Lα-LA預(yù)處理組Beclin-1蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其余差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.Na As O2可誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞自噬性死亡,其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT-m TOR信號(hào)通路有關(guān)。2.α-LA可能通過(guò)介導(dǎo)PI3K/AKT-m TOR信號(hào)通路對(duì)Na As O2誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞自噬性死亡發(fā)揮保護(hù)作用。
【圖文】：

計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，，以時(shí)間天（d）為橫坐標(biāo)，以活細(xì)曲線，結(jié)果表明：細(xì)胞接種后第 1 d 細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始增加，在長(zhǎng)期，第 3~5 d 細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始平臺(tái)期，第 6 d 細(xì)胞數(shù)目顯微鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞碎片增多。由此可知 INS-1 細(xì)開(kāi)始對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，可用于實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖 2-1）。NaAsO2誘導(dǎo) INS-1 細(xì)胞死亡過(guò)程中的作用研究胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

表 2-1 NaAsO2對(duì) INS-1 細(xì)胞增殖抑制率（%）的影響（ x ±s，n=3）Table. 2-1 Effect of NaAsO2on proliferation inhibition rate (%) of INS-1 cells ( x ±s，n=3組別 濃度（μmol/L） OD 值 增殖抑制率（%）空白對(duì)照組 - 1.41±0.01 -NaAsO2組 120 0.10±0.01*92.71±0.6560 0.28±0.05*80.09±3.2230 0.70±0.03*50.50±2.3115 0.94±0.02*33.30±2.155 1.24±0.04*11.68±1.80注: 與空白對(duì)照組比較，*表示 P ＜0. 05。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R965

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本文編號(hào)：2591376