【摘要】：目的:1.制備SPIO(超順磁氧化鐵納米粒)示蹤的MISO(米索硝唑)pH敏感脂質(zhì)體,并優(yōu)化處方及制備工藝;2.建立測定SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體中MISO的含量及體外釋放度的方法;3.建立測定SPIO示蹤的MISO p H敏感脂質(zhì)體SPIO的含量及體外釋放度的方法。4.構(gòu)建人肺腺癌A549細胞系乏氧模型,模擬實體腫瘤乏氧微環(huán)境;5.考察SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體體外pH敏感特異性。方法:1、采用逆相蒸發(fā)法+凍融法制備SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體,以包封率及體外釋放度為考察指標,采用正交設(shè)計,并篩選最優(yōu)處方。2、采用金屬粒子沉淀法+紫外光譜法,測定MISO pH敏感脂質(zhì)體藥物含量及體外釋放度;3.采用鄰菲羅啉分光光度法測定SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體溶液中的SPIO的含量及體外釋放度;4.采用二氯化鈷(Cobaltous Chloride,Co Cl_2)化學(xué)誘導(dǎo)法構(gòu)建乏氧模型,體外培養(yǎng)的A549細胞分別加入不同濃度CoCl_2培養(yǎng)液作用不同的時間(24h,48h,72h),采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測乏氧對A549細胞增殖的影響并篩選出合適的濃度和作用時間;5、以人肺腺癌細胞A549為細胞模型,分乏氧實驗組和常氧對照組,乏氧實驗組加入適當(dāng)濃度CoCl_2培養(yǎng)基作用適當(dāng)時間,常氧對照組加入無血清培養(yǎng)基作用相同時間,然后給予空白脂質(zhì)體和載藥脂質(zhì)體,分別孵育2h,4h,8h,16h,24h后對細胞進行預(yù)處理。用紫外光譜法測定胞外MISO藥物濃度;用原子吸收光譜法測定胞外SPIO濃度,并與對照組比較。結(jié)果:1.HPLC(高效液相色譜法)證實ZnCl_2可完全沉淀磷脂酰乙醇胺,標準曲線為:A=0.0328C-0.008,r=0.9996(n=6),線性范圍為:0.96~30.72μg·mL~(-1),回收率在98%~102%之間,RSD2%(n=3)。供試品含量平均質(zhì)量分數(shù)100.11%,釋放度試驗中SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體在pH5.5,pH6.5,pH7.4的緩沖液中,24h累計釋放度分別為63.4%、39.6%、30.6%;2.采用鄰菲羅啉分光光度法檢測SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體的鐵含量及釋放度,求得到標準曲線為:A=0.1031C+0.0032,r=0.9995(n=6),線性范圍為:0.20~8.00μg·mL~(-1),回收率在98%~102%之間,RSD2%(n=3);3.通過正交試驗優(yōu)化并綜合分析,兼顧MISO及SPIO包封率與累計釋放度,最終確定制備SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體的最佳處方為:PE(磷脂酰乙醇胺):CHO(膽固醇):LA(亞油酸):CMC(羧甲基殼聚糖)(W/W)3:1:1:0.05,有機相:水相(V/V)4:1,藥脂比1:20,PBS量8ml;冷凍:融化溫度-80:50,SPIO量20%,凍融次數(shù)3次,冷凍:融化時間50:30。通過上述方法學(xué)測定,其中MISO的包封率為30.2%,SPIO包封率為23.7%。在不同p H條件下的釋放度測試,結(jié)果顯示SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體,在pH5.5、p H6.5、pH7.4的緩沖液中MISO 24h的累計釋放度分別為81.1%、60.6%、32.5%。SPIO 24h的累計釋放度分別為90.4%、64.5%、36.6%。用粒度/Zeta電位測定儀測得SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體粒徑呈現(xiàn)正態(tài)分布趨勢,平均粒徑為950nm左右,點位圖提示其帶負電荷,為-58.9mV。掃描電鏡顯示,SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體呈圓形或類圓形,形體較均勻;透射電鏡顯示制備的SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體呈類圓形黑色點。磁化曲線顯示SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體具有超順磁性。4.當(dāng)CoCl_2濃度200μmol/L作用24 h時,細胞增值抑制率未出現(xiàn)明顯變化,隨著CoCl_2濃度的增加(≥200μmol/L)或者時間的延長,細胞增殖抑制明顯,其抑制作用與Co Cl_2呈劑量-時間依賴關(guān)系。5.加入不同濃度的SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體后,常氧對照組與乏氧實驗組在同一濃度的不同時間條件下,常氧對照組上清液中MISO濃度較乏氧實驗組低,通過統(tǒng)計學(xué)方差分析,其比較有顯著性差異(P0.0001);常氧對照組與乏氧實驗組在不同濃度條件下,其上清液中MISO濃度的比較也有顯著性差異(P0.0001)。結(jié)論:1、采用逆相蒸發(fā)法+凍融法制備高包封率和高載藥量SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體,制得的脂質(zhì)體性質(zhì)穩(wěn)定,載藥量高。2、紫外光譜結(jié)合金屬粒子沉淀法測定方法結(jié)果準確可靠、重現(xiàn)性好,與HPLC法比較,具有簡便、快速的優(yōu)點,可作為MISO pH敏感脂質(zhì)體的質(zhì)量控制方法。3、鄰菲羅啉分光光度法測定SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體內(nèi)的SPIO含量以及釋放度,選擇性好,顯色靈敏,結(jié)果滿意。4、Co Cl_2化學(xué)誘導(dǎo)法建立腫瘤細胞乏氧模型,模擬實體腫瘤乏氧微環(huán)境,方法簡單,重復(fù)性好。5、SPIO示蹤的MISO pH敏感脂質(zhì)體具有高度pH敏感性。
【圖文】：

其放療高效增敏優(yōu)勢，解決放療增敏劑高效高毒、無毒低效的問題，為其再次進入臨床打下基礎(chǔ)，向臨床提供一種高效無毒的放療增敏劑。圖1. 米索硝唑結(jié)構(gòu)式Figure1. Misozonazole chemical structure

西 南 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文結(jié) 果考察的確定2 可知，MISO 在 322nm 處有最大吸收，由圖 3 可知，輔 322nm 處仍有較大吸收，對藥物測定干擾最大，，膽固 E、羧甲基殼聚糖，在 322nm 處無吸收，對藥物測定過單純破乳、離心處理后進行藥物測定時，無法消除磷測定的影響。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R943

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本文編號：2591320