【摘要】：研究背景和目的:上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在前列腺癌轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色,因此,開發(fā)EMT抑制劑可能是治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌的可行策略。Arenobufagin是本課題組從蟾酥中分離得到的抗腫瘤藥物先導(dǎo)物,能抑制多種實(shí)體腫瘤的增殖。本課題的目的是評價arenobufagin能否抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移,并揭示其作用機(jī)制。研究方法:(1)MTT法檢測arenobufagin對PC3細(xì)胞的非毒劑量;(2)羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞骨架的變化;(3)蛋白免疫印跡法檢測PC3細(xì)胞EMT標(biāo)志物的表達(dá)水平;(4)Wound healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)評價arenobufagin對PC3細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響;(5)免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察arenobufagin對β-catenin核轉(zhuǎn)位的影響;(6)qPCR檢測β-catenin/TCF/LEF-1復(fù)合物相關(guān)靶基因的mRNA水平;(7)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測β-catenin/TCF/LEF-1復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性;(8)在PC3細(xì)胞上瞬時轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)質(zhì)粒和β-catenin siRNA,考察β-catenin在arenobufagin介導(dǎo)的EMT抑制作用中扮演的角色;(9)構(gòu)建裸鼠皮下異移植瘤模型和肺轉(zhuǎn)移瘤模型,體內(nèi)評價arenobufagin抑制PC3細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移的活性;免疫組化法檢測異移植瘤EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;HE染色觀察肺組織轉(zhuǎn)移灶的形成以及各臟器組織的病理情況。研究結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)測得arenobufagin對PC3細(xì)胞的非毒劑量為8 nM,即細(xì)胞增殖抑制率為10%對應(yīng)的藥物濃度;羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,arenobufagin處理前后,PC3細(xì)胞的形態(tài)由間質(zhì)表型(紡錘體型)轉(zhuǎn)換成上皮表型(圓形);蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,arenobufagin下調(diào)間質(zhì)表型標(biāo)志物(ZEB1、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug和Twist1),上調(diào)上皮表型標(biāo)志物(E-cadherin、ZO-1和Claudin-1)的表達(dá);Wound healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,arenobufagin抑制PC3細(xì)胞的遷移和侵襲能力;以上結(jié)果表明arenobufagin抑制PC3細(xì)胞的EMT。另外,arenobufagin下調(diào)了PC3細(xì)胞β-catenin的mRNA和蛋白水平;免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,arenobufagin抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)位;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,arenobufagin抑制β-catenin/TCF/LEF-1復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性;qPCR結(jié)果顯示,arenobufagin下調(diào)β-catenin/TCF/LEF-1復(fù)合物調(diào)控的與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因mRNA水平。β-catenin的過表達(dá)和敲低分別拮抗和協(xié)同arenobufagin抑制PC3細(xì)胞EMT的活性,說明β-catenin參與了arenobufagin抑制PC3細(xì)胞EMT的作用。體內(nèi)活性評價數(shù)據(jù)顯示,arenobufagin抑制PC3細(xì)胞裸鼠移植瘤的EMT間質(zhì)標(biāo)志物,上調(diào)上皮標(biāo)志物的表達(dá),減少肺轉(zhuǎn)移灶的形成,同時arenobufagin對裸鼠各臟器組織無明顯損害作用。研究結(jié)論:本研究首次揭示arenobufagin通過下調(diào)β-catenin抑制PC3細(xì)胞EMT,從而抑制前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,為arenobufagin發(fā)展成為治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌的候選藥物提供理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 EMT 發(fā)生過程（J Clin Invest. 2009; 119(6): 1420 1428.）1.2.1 與 EMT 相關(guān)的信號通路細(xì)胞中的EMT過程是由生長因子（EGF，PDGF，HGF）或其它信號蛋白如TGF-β/Smad，音猬因子（Sonic hedgehog，Shh），Wnt /β-catenin 和 ECM 組分等驅(qū)動[19]，其中 TGF-β/Smad和 Wnt /β-catenin 是調(diào)控 EMT 的兩條主要通路。TGF-β 除了通過 SMAD 蛋白促進(jìn) EMT，也可以激活 PI3K-AKT，，ERK MAPK，p38 MAPK 和 JNK 通路。TβRI 磷酸化銜接蛋白SRC 同源 2 結(jié)構(gòu)域包含的轉(zhuǎn)化 A（SRC homology 2 domain-containing-transforming A，SHCA），SHCA接著激活生長因子受體結(jié)合蛋白2（Growth factor receptor-bound protein 2，GRB2）和交換因子（Son of sevenless，SOS），從而激活 RAS-RAF-MEK-ERK MAPK 通路，促使 EMT 發(fā)生。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）與TGF-β受體復(fù)合物相互作用后，激活TGF-β激活激酶（TGF-β-activated kinase 1，TAK1），p38 MAPK 和 JNK。一些生長因子，包括表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF），

圖 1-2 與 EMT 相關(guān)的信號通路（Nat Rev Mol Cell Biol. 2014; 15(3): 178-96.）1.2.1.1 TGF-β/Smad 通路TGFβ 是 EMT 最主要的誘導(dǎo)因子，對非腫瘤性上皮細(xì)胞來說是生長抑制劑，而在晚期癌癥中是腫瘤啟動子[16]。TGFβ 通常通過 TβRII（II 型；也稱為 TGFR2）和 TβRI（I 型；也稱為TGFR1）受體的復(fù)合物啟動信號通路，受體激活的SMAD2和/或SMAD3與SMAD4結(jié)合形成三聚體 SMAD 復(fù)合物，隨后，SMAD 復(fù)合物發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與調(diào)控基因序列上的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，并通過與轉(zhuǎn)錄共激活因子或轉(zhuǎn)錄共抑制因子相互作用來激活或抑制轉(zhuǎn)錄[21, 22]。TGFβ 通路激活后，SMAD 復(fù)合物不僅能夠激活 EMT 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，也能夠提高它們的活性。TGFβ 通過 SMAD3 依賴性轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo) Snail1 表達(dá)[23]，而 SMAD3 誘導(dǎo)的心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Myocardin-related transcription factor，MRTF）表達(dá)可間接誘導(dǎo) Snail2表達(dá)[24]，SMAD3-SMAD4 也與 Snail1 協(xié)同應(yīng)答 TGFβ，從而抑制編碼 E-cadherin 和 occludin[25][26]
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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