【摘要】：目的:本研究擬在缺氧環(huán)境下,采用不同濃度的BaP處理A549細(xì)胞,探討B(tài)aP對分子伴侶介導(dǎo)自噬(CMA)的作用是否與HSP90有關(guān)。方法:(1)采用CoCl_2構(gòu)建細(xì)胞缺氧環(huán)境,qPCR法檢測HIF-1α的mRNA表達(dá),確定缺氧環(huán)境是否構(gòu)建成功;(2)采用qPCR和Western bolt法檢測缺氧環(huán)境對A549細(xì)胞中HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表達(dá)影響;(3)采用qPCR和Western bolt法檢測不同濃度BaP對缺氧環(huán)境下A549細(xì)胞中HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表達(dá)影響;(4)采用qPCR和Western bolt法檢測BaP對缺氧環(huán)境下給予HSP90抑制劑Geldanamycin(GA)和沉默HSP90α的A549細(xì)胞中HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表達(dá)情況;(5)采用堿性彗星實驗、免疫熒光檢測γ-H2AX焦點實驗、qPCR和Western bolt法檢測不同濃度BaP對A549細(xì)胞中DNA損傷與細(xì)胞內(nèi)HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討DNA損傷與CMA的關(guān)系。結(jié)果:(1)與常氧組比較,A549細(xì)胞在不同時間缺氧后,HIF-1α的mRNA表達(dá)量均有一定程度的增加,以缺氧24h后HIF-1α的mRNA表達(dá)量最高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001);(2)缺氧環(huán)境下,HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表達(dá)量與常氧組相比均明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);(3)缺氧環(huán)境下,1μM BaP作用于A549細(xì)胞24h時,HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著降低,與空白組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);(4)缺氧環(huán)境下,給予GA和沉默HSP90α的A549細(xì)胞可以增強(qiáng)BaP對HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表達(dá)量的抑制作用,與BaP組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);(5)常氧環(huán)境下,不同濃度BaP作用于A549細(xì)胞24h時,細(xì)胞內(nèi)DNA單、雙鏈斷裂的損傷程度及HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表達(dá)量均隨著BaP濃度的增加而增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.缺氧可以促進(jìn)A549細(xì)胞的CMA;2.在缺氧環(huán)境下,BaP對CMA有抑制作用;3.在缺氧環(huán)境下,HSP90抑制劑和沉默HSP90α的A549細(xì)胞可以增強(qiáng)BaP對CMA的抑制作用;4.在常氧環(huán)境下,BaP可以導(dǎo)致DNA損傷和CMA相關(guān)。
【圖文】：

國碧云天）操作：標(biāo)準(zhǔn)品依照表5配制，樣品孔加5μL蛋白和15μLPBS。最后在每孔加入200μLBCA工作液（A:B=50:1），室溫放置2h。酶標(biāo)儀測量吸光度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白定量，見圖1。取定量蛋白80μL和20μL蛋白上樣緩沖液混勻，100℃變性10min，-20℃保存。表5 BCA蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)品配制終濃度（mg/mL） 0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.5mg/mL BSA（μL） 0 1 2 4 8 12 16 20PBS（μL） 20 19 18 16 12 8 4 02）SDS-PAGE凝膠電泳配制 10%分離膠（30%Acr/Bic：1.0moL/L Tris·HCL pH8.8：ddH2O：10% SDS：10%APS：TEMED = 6.7mL：7.6mL：5.3mL：200μL：200μL：8μL）和 5%濃縮膠（30%Acr/Bic：1moL/LTris·HCL pH6.8：ddH2O：10% SDS：10% APS：TEMED= 1mL：0.75mL：4.1mL：60μL：60μL：6μL），快速混勻并灌膠插入梳子，待凝固。倒入 1×電泳緩沖液至刻度線上開始上樣，，每孔 16μL，避免交叉污染。電壓 80V，30min；120V，約 2h

VDF膜、凝膠、濾紙，排盡氣泡，合上陰極電板。插上電源，設(shè)置電流200mA，120min[26]。配制5%脫脂奶粉（脫脂奶粉：TB于室溫封閉1.5h，TBST清洗3次，每次10min，切膜并將條帶分α、HSP90、HSC70、LAMP-2A孵育盒中，4℃孵育過夜，TBSTin；再放于二抗中，室溫避光孵育1h，TBST清洗3次，每次10析條帶灰度值。環(huán)境下，不同濃度 BaP 對 A549 細(xì)胞 HIF-1α、HSP90、A 表達(dá)的影響P 濃度的選擇實驗室前期工作基礎(chǔ)摸索 BaP 濃度在 0-10μM 范圍內(nèi)，作用 A549 細(xì)胞的增殖影響不顯著。因而本實驗選定 BaP 濃度為 0作用 24h 進(jìn)行后續(xù)實驗，見圖 2。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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5 徐龍;蘇冰;杜成;韓濤;劉兆U

本文編號：2590516