【摘要】：目的:研究線粒體信號通路和JNK通路對氯化鎘誘導(dǎo)MC3T3-E1 Subclone14細胞凋亡的影響,以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對氯化鎘誘導(dǎo)細胞凋亡的作用,為防治鎘引起的骨代謝疾病提供理論基礎(chǔ)。方法:1.CCK-8法檢測EGCG與氯化鎘對細胞存活率的影響。2.ALP試劑盒檢測EGCG與氯化鎘對細胞ALP活力的影響。3.光學(xué)顯微鏡觀察氯化鎘對細胞形態(tài)的影響,Annexin V-FITC/PI、Hoechst和TUNEL熒光染色法觀察氯化鎘對細胞凋亡的影響。4.JC-1法檢測EGCG與氯化鎘對細胞線粒體膜電位的影響。5.QPCR法檢測EGCG與氯化鎘對細胞轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、I型膠原COL-1和凋亡相關(guān)基因Caspase 9、Caspase 3、Bcl-2、Bax和Cytoc表達的影響。6.免疫熒光法檢測Z-VAD-FMK與氯化鎘對細胞cleaved-caspase 3蛋白表達的影響。7.Western-blot法檢測Z-VAD-FMK、SP600125、EGCG與氯化鎘對細胞成骨相關(guān)蛋白RUNX2、COL-1、ALP和凋亡相關(guān)蛋白Caspase 9、Caspase 3、Bcl-2、Bax和Cytoc表達以及JNK、p-JNK蛋白表達的影響。結(jié)果:1.與對照組比較,5、10、20、30、40、50、100μM氯化鎘單獨處理細胞60 h后,細胞存活率均顯著降低(P0.01);10μM氯化鎘能誘導(dǎo)細胞凋亡;5、10、20μM氯化鎘能明顯降低細胞Caspase 9、Cytoc蛋白的表達和Bcl-2/Bax的比值(P0.05),升高p-JNK/JNK比值(P0.05);5、10、20μM氯化鎘顯著性降低RUNX2、COL-1基因表達(P0.01);20μM氯化鎘能明顯抑制ALP活性并降低RUNX2、COL-1蛋白表達(P0.05),而5、10μM氯化鎘對其無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.Caspase抑制劑Z-VAD-FMK與20μM氯化鎘單獨或聯(lián)合處理細胞60 h后,未處理組細胞呈纖維狀,氯化鎘處理組細胞皺縮呈圓泡狀,Z-VAD-FMK與氯化鎘聯(lián)合處理后細胞皺縮數(shù)目減少;與氯化鎘單獨處理組比較,Z-VAD-FMK與氯化鎘聯(lián)合處理組能顯著升高Caspase 9蛋白表達和Bcl-2/Bax的比率,并使cleaved-caspase 3蛋白表達顯著性降低(P0.05);與氯化鎘單獨處理組比較,Z-VAD-FMK與氯化鎘聯(lián)合處理組顯著升高RUNX2蛋白的表達(P0.05),而對ALP、COL-1無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.JNK抑制劑SP600125預(yù)處理1 h,20μM氯化鎘干預(yù)細胞60 h后,SP600125能改善鎘引起的細胞形態(tài)變化,顯著降低鎘引起的JNK磷酸化水平的升高并顯著抑制Bcl-2/Bax比值的降低(P0.01或P0.05),而對鎘降低的凋亡相關(guān)蛋白Caspase 9、Cytoc以及成骨相關(guān)蛋白RUNX2、ALP和COL-1表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。4.EGCG與氯化鎘單獨或共同處理細胞60 h后,與氯化鎘組比較,EGCG與鎘聯(lián)合處理組細胞存活率和線粒體膜電位顯著性升高;Caspase 9基因和蛋白表達及Bcl-2/Bax的比率顯著性增加,p-JNK/JNK比值明顯降低(P0.05);ALP活性明顯升高(P0.05)。結(jié)論:1.氯化鎘能降低MC3T3-E1 Subclone14存活率并誘導(dǎo)細胞凋亡;抑制ALP活性并下調(diào)RUNX2、COL-1基因和蛋白的表達;2.氯化鎘通過線粒體Caspase依賴型途徑和激活JNK通路誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡;3.EGCG能降低鎘誘導(dǎo)的細胞損傷率和細胞凋亡率,其保護作用可能是通過上調(diào)Caspase 9和Bcl-2/Bax比值并下調(diào)p-JNK/JNK比值來實現(xiàn)的。
【圖文】：

圖 1 線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡表沒食子兒茶素沒食子酸酯 EGCG 的藥理作用中國是茶的發(fā)源地，飲茶文化在中國已經(jīng)歷經(jīng)四五千年了。茶具有保健作用，能減病的發(fā)病風(fēng)險，，降低膽固醇，防治老年癡呆，增強免疫力等。茶的有效活性成分有酚、茶色素、茶氨酸、茶多糖等。茶多酚是綠茶中含量最多的可溶性物質(zhì)。綠茶的與各種疾病，包括癌癥、心血管疾病、糖尿病、過敏、哮喘、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)系統(tǒng)問肥胖癥的發(fā)病率較低有關(guān)。報道表明，綠茶有許多好處，如調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫、食欲和腦功能，這些與兒茶素的抗氧化和自由基清除活性相關(guān)。其他研究證實茶對髖部骨折有保護作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是茶多酚的有效活性物是一種多酚類物質(zhì)，在綠茶中的含量最高。EGCG 是一種黃烷醇類化合物，對金屬

圖 2 EGCG 分子結(jié)構(gòu)圖EGCG 具有廣泛的治療特性，包括抗動脈粥樣硬化、抗心病、抗炎和抗氧化作用。這些治療作用主要與抑制 LDL 膽 NF-κB(抗心臟肥大)，抑制 MPO 活性(抗心肌梗塞)，降低平(抗糖尿病)，炎癥標(biāo)志物的減少(抗炎)以及 ROS 產(chǎn)生的抑 具有多種藥理活性，比如抗氧化、解毒、抗紫外輻射、抗，EGCG 的這些藥理作用得到了深入的研究。合重金屬作用證明，EGCG 能夠抗氧化且具有螯合重金屬的作用。EGC功能障礙和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[45]；減輕砷誘導(dǎo)的大鼠心臟毒起的大鼠腎損傷[47]；緩解小鼠造血系統(tǒng)的輻射損傷，并且
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R99

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本文編號：2590468