【摘要】：目的腫瘤是人類面臨最嚴(yán)重的疾病之一,其具有侵襲性強(qiáng)、瘤體增長迅速、對(duì)抗化療和術(shù)后復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn),在全球范圍內(nèi)影響人類健康。因此,研制安全、有效的藥物傳遞系統(tǒng)和治療方法來對(duì)抗腫瘤十分迫切和必要。近年來研究表明,青蒿素及其衍生物被認(rèn)為具有廣泛的抗腫瘤活性,且具有明顯的抗腫瘤作用。查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知青蒿琥酯具有一定的抗腫瘤活性,但呈濃度依賴性,低濃度的青蒿琥酯(Ats)抗腫瘤作用不理想,但濃度過高會(huì)產(chǎn)生骨髓抑制等副作用。為了獲得更好的抗腫瘤效果,本實(shí)驗(yàn)采用青蒿琥酯作為模型藥物,以牛血清白蛋白(BSA)為載體,制備青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒。以SMMC-7721和PLC細(xì)胞株為研究對(duì)象,分析和研究了青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒(Ats-BSA-NPs)對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體的靶向作用及體外抗腫瘤活性。方法采用去溶劑化法以牛血清白蛋白為載體材料,制備青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒。采用單因素考察法對(duì)青蒿琥酯溶液濃度、牛血清白蛋白溶液的濃度及青蒿琥酯溶液的滴加速度等進(jìn)行篩選分析,獲得最優(yōu)處方工藝。對(duì)該納米粒進(jìn)行相關(guān)體外表征,包括外觀、粒徑、Zeta電位和釋放度等。采用MTT比色分析法檢測不同時(shí)間間隔游離青蒿琥酯與青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響。用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察JC-1染料熒光強(qiáng)度的變化,觀察游離青蒿琥酯溶液和Ats-BSA-NPs處理后腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的變化,隨后對(duì)其細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生情況進(jìn)行定量分析,最后用Western Blot考察游離青蒿琥酯溶液和Ats-BSA-NPs對(duì)細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白及細(xì)胞色素C的調(diào)節(jié)情況。結(jié)果通過單因素考察得到最佳處方為青蒿琥酯溶液濃度500μg/mL,牛血清白蛋白溶液濃度35 mg/mL,青蒿琥酯溶液的滴加速度30滴/min,按照最優(yōu)處方獲得的納米粒的包封率值為82.4%,載藥量值為13.3%,包封率及載藥量良好。將Ats-BSA-NPs進(jìn)行表征分析,透射電鏡下的Ats-BSA-NPs呈完整的球形,分散指數(shù)為0.016,平均粒徑為99.9±2.3 nm,結(jié)果表明納米粒大小均勻呈良好的分散狀態(tài)。納米粒的Zeta電位為負(fù)值,大小為-25.6±4.3 mV。與游離藥物在體外的快速釋放相比,Ats-BSA-NPs釋放速度較緩慢,并且由于Ats-BSA-NPs的持續(xù)降解,表現(xiàn)出一種平穩(wěn)而持久的釋放模式。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與游離的青蒿琥酯相比較,Ats-BSA-NPs對(duì)SMMC-7721腫瘤細(xì)胞和PLC腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性和更高的靈敏度,對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制作用。通過共聚焦顯微鏡觀察兩種腫瘤細(xì)胞內(nèi)的納米粒的分布和定位,結(jié)果表明Ats-BSA-NPs能夠靶向到線粒體上并使線粒體膜受到嚴(yán)重?fù)p傷,導(dǎo)致線粒體膜去極化。腫瘤細(xì)胞被游離藥物和Ats-BSA-NPs處理一定時(shí)間后,細(xì)胞內(nèi)ROS含量也隨之增加,呈現(xiàn)時(shí)間依賴性關(guān)系,并且由Ats-BSA-NPs處理過的細(xì)胞產(chǎn)生的ROS明顯較多,說明Ats-BSA-NPs具有更強(qiáng)的殺傷力。為了探討細(xì)胞死亡對(duì)游離藥物和Ats-BSA-NPs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)采用Western Blot方法檢測細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒實(shí)現(xiàn)了在線粒體內(nèi)的積累,激活線粒體介導(dǎo)的凋亡效應(yīng),從而提高了Caspase-3和Caspase-9相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)導(dǎo)致明顯的細(xì)胞凋亡。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)以牛血清白蛋白為載體,采用去溶劑化法制備的青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒,粒徑呈完整的球形,大小均勻,且具有良好的緩釋效果。通過熒光攝取實(shí)驗(yàn)、MTT和流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot等體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步的探討和研究,表明青蒿琥酯可以通過牛血清白蛋白納米粒靶向到線粒體,破壞線粒體的完整性導(dǎo)致膜電位下降從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)了青蒿琥酯抗腫瘤活性。
【圖文】：

收率測定青蒿琥酯溶液，將其制備成高、中、低三種濃度（2.0、1.0、0.，于一天內(nèi)分別測定 3 次取其平均吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲琥酯溶液濃度，計(jì)算回收率。青蒿琥酯含量測定方法的建立大吸收波長的選擇《中國藥典》2015 年版青蒿琥酯項(xiàng)下方法，選擇檢測波長為準(zhǔn)曲線的繪制示，根據(jù)回歸方程 A=0.1572C+0.0055，相關(guān)系數(shù) r=0.999 0.05-2.5 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

琥酯溶液濃度的選擇琥酯溶液的增加，納米粒的載藥量和包封率呈先增加后 500 μg/mL 時(shí)，載藥量開始呈現(xiàn)下降趨勢，，所以最終選 500 μg/mL。琥酯溶液滴加速度的選擇琥酯溶液滴加速度的增加，包封率不斷增大，但當(dāng)?shù)嗡俾食式档挖厔�，所以最終選擇 30 滴/min 為最佳滴加青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒的表征分析學(xué)考察觀察到，Ats-BSA-NPs 分散均勻，呈完整的球形或類
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96;R943;TB383.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2590067