【摘要】：目的腫瘤是人類面臨最嚴重的疾病之一,其具有侵襲性強、瘤體增長迅速、對抗化療和術后復發(fā)率高等特點,在全球范圍內影響人類健康。因此,研制安全、有效的藥物傳遞系統(tǒng)和治療方法來對抗腫瘤十分迫切和必要。近年來研究表明,青蒿素及其衍生物被認為具有廣泛的抗腫瘤活性,且具有明顯的抗腫瘤作用。查閱相關文獻得知青蒿琥酯具有一定的抗腫瘤活性,但呈濃度依賴性,低濃度的青蒿琥酯(Ats)抗腫瘤作用不理想,但濃度過高會產生骨髓抑制等副作用。為了獲得更好的抗腫瘤效果,本實驗采用青蒿琥酯作為模型藥物,以牛血清白蛋白(BSA)為載體,制備青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒。以SMMC-7721和PLC細胞株為研究對象,分析和研究了青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒(Ats-BSA-NPs)對腫瘤細胞線粒體的靶向作用及體外抗腫瘤活性。方法采用去溶劑化法以牛血清白蛋白為載體材料,制備青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒。采用單因素考察法對青蒿琥酯溶液濃度、牛血清白蛋白溶液的濃度及青蒿琥酯溶液的滴加速度等進行篩選分析,獲得最優(yōu)處方工藝。對該納米粒進行相關體外表征,包括外觀、粒徑、Zeta電位和釋放度等。采用MTT比色分析法檢測不同時間間隔游離青蒿琥酯與青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒對腫瘤細胞活力的影響。用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察JC-1染料熒光強度的變化,觀察游離青蒿琥酯溶液和Ats-BSA-NPs處理后腫瘤細胞線粒體膜電位的變化,隨后對其細胞內活性氧(ROS)的產生情況進行定量分析,最后用Western Blot考察游離青蒿琥酯溶液和Ats-BSA-NPs對細胞相關凋亡蛋白及細胞色素C的調節(jié)情況。結果通過單因素考察得到最佳處方為青蒿琥酯溶液濃度500μg/mL,牛血清白蛋白溶液濃度35 mg/mL,青蒿琥酯溶液的滴加速度30滴/min,按照最優(yōu)處方獲得的納米粒的包封率值為82.4%,載藥量值為13.3%,包封率及載藥量良好。將Ats-BSA-NPs進行表征分析,透射電鏡下的Ats-BSA-NPs呈完整的球形,分散指數為0.016,平均粒徑為99.9±2.3 nm,結果表明納米粒大小均勻呈良好的分散狀態(tài)。納米粒的Zeta電位為負值,大小為-25.6±4.3 mV。與游離藥物在體外的快速釋放相比,Ats-BSA-NPs釋放速度較緩慢,并且由于Ats-BSA-NPs的持續(xù)降解,表現出一種平穩(wěn)而持久的釋放模式。MTT實驗結果表明與游離的青蒿琥酯相比較,Ats-BSA-NPs對SMMC-7721腫瘤細胞和PLC腫瘤細胞具有更強的細胞毒性和更高的靈敏度,對腫瘤細胞具有更強的抑制作用。通過共聚焦顯微鏡觀察兩種腫瘤細胞內的納米粒的分布和定位,結果表明Ats-BSA-NPs能夠靶向到線粒體上并使線粒體膜受到嚴重損傷,導致線粒體膜去極化。腫瘤細胞被游離藥物和Ats-BSA-NPs處理一定時間后,細胞內ROS含量也隨之增加,呈現時間依賴性關系,并且由Ats-BSA-NPs處理過的細胞產生的ROS明顯較多,說明Ats-BSA-NPs具有更強的殺傷力。為了探討細胞死亡對游離藥物和Ats-BSA-NPs誘導的細胞凋亡的相互關系,本實驗采用Western Blot方法檢測細胞凋亡蛋白的表達。通過實驗結果發(fā)現,青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒實現了在線粒體內的積累,激活線粒體介導的凋亡效應,從而提高了Caspase-3和Caspase-9相關凋亡蛋白的表達導致明顯的細胞凋亡。結論本實驗以牛血清白蛋白為載體,采用去溶劑化法制備的青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒,粒徑呈完整的球形,大小均勻,且具有良好的緩釋效果。通過熒光攝取實驗、MTT和流式細胞術及Western Blot等體外抗腫瘤實驗進行了初步的探討和研究,表明青蒿琥酯可以通過牛血清白蛋白納米粒靶向到線粒體,破壞線粒體的完整性導致膜電位下降從而促進細胞凋亡,增強了青蒿琥酯抗腫瘤活性。
【圖文】：

收率測定青蒿琥酯溶液，將其制備成高、中、低三種濃度（2.0、1.0、0.，于一天內分別測定 3 次取其平均吸光度值，根據標準曲琥酯溶液濃度，計算回收率。青蒿琥酯含量測定方法的建立大吸收波長的選擇《中國藥典》2015 年版青蒿琥酯項下方法，選擇檢測波長為準曲線的繪制示，根據回歸方程 A=0.1572C+0.0055，相關系數 r=0.999 0.05-2.5 mg/mL 范圍內呈良好的線性關系。

琥酯溶液濃度的選擇琥酯溶液的增加，納米粒的載藥量和包封率呈先增加后 500 μg/mL 時，載藥量開始呈現下降趨勢，，所以最終選 500 μg/mL。琥酯溶液滴加速度的選擇琥酯溶液滴加速度的增加，包封率不斷增大，但當滴速率呈降低趨勢，所以最終選擇 30 滴/min 為最佳滴加青蒿琥酯牛血清白蛋白納米粒的表征分析學考察觀察到，Ats-BSA-NPs 分散均勻，呈完整的球形或類
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96;R943;TB383.1

【參考文獻】

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本文編號：2590067