【摘要】：盡管高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法(Highly Active Anti-retroviral Therapy,HAART)成功應(yīng)用于艾滋病患者,有效的控制患者體內(nèi)HIV病毒,延長(zhǎng)了患者的生存期,然而患者體內(nèi)由于HIV病毒潛伏儲(chǔ)存庫(kù)的存在而需要終生服藥。當(dāng)前對(duì)于如何清除HIV潛伏病毒庫(kù)的策略主要是“Shock and Kill”,即激活HIV潛伏感染,再應(yīng)用HAART藥物或者提高機(jī)體免疫系統(tǒng)等方法清除活化的潛伏病毒庫(kù),最終達(dá)到HIV功能性治愈的目的,使患者不需要長(zhǎng)期使用藥物而維持HIV病毒不反彈。目前針對(duì)HIV潛伏庫(kù)的形成和持續(xù)存在機(jī)制研究,開(kāi)發(fā)了通過(guò)不同通路重新活化HIV潛伏感染細(xì)胞的激活劑。盡管少數(shù)藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn),但也存在著無(wú)法減少HIV潛伏庫(kù)大小、特異性差和毒副作用大等缺陷。因此,新的HIV潛伏激活靶點(diǎn)的研究,進(jìn)而開(kāi)發(fā)新型潛伏激活劑的策略是未來(lái)HIV潛伏激活方面的研究熱點(diǎn)。熱休克因子(Heatshockfactor,HSF)是熱休克反應(yīng)中的關(guān)鍵因子,廣泛存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子。在非應(yīng)激狀態(tài)下,HSF1主要是以無(wú)活性的單體形式存在。當(dāng)受到刺激時(shí),HSF1形成有活性的三聚體形式進(jìn)入細(xì)胞核,同時(shí)發(fā)生各種修飾。我們前期研究發(fā)現(xiàn),HSF1可能是潛伏HIV激活過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,基于此靶點(diǎn)的藥物有可能成為新型的HIV潛伏感染激活劑。此前研究使用的藥物成藥性低且具有一定毒副作用,可能是靶點(diǎn)選擇性不高的原因。因此本課題旨在確證HSF1為新型HIV潛伏感染激活劑的藥物作用靶點(diǎn),并為下一步開(kāi)發(fā)出作用于HSF1的安全高效的新型潛伏感染激活劑提供理論基礎(chǔ)。本課題首先利用CRISPR/Cas9技術(shù),建立敲除HSF1的HIV潛伏感染細(xì)胞模型,應(yīng)用經(jīng)典潛伏感染激活劑和已報(bào)道的通過(guò)活化HSF1蛋白而促進(jìn)HIV潛伏激活的藥物,作用于未敲除細(xì)胞和敲除HSF1的細(xì)胞,隨后通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)、蛋白印跡等方法驗(yàn)證敲除了 HSF1蛋白后,經(jīng)典潛伏感染激活劑并不會(huì)顯著下調(diào)HIV潛伏感染水平,而通過(guò)活化HSF1而激活HIV潛伏感染的藥物其HIV潛伏激活能力明顯下調(diào)。為探究這一現(xiàn)象,我們構(gòu)建了 HSE驅(qū)動(dòng)的Luciferase-HSE質(zhì)粒,通過(guò)慢病毒感染的方式整合到HEK-293T細(xì)胞中,構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Luciferase-HSE的HEK-293TLuciferase細(xì)胞。再利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)該細(xì)胞的HSFI基因進(jìn)行敲除,篩選得到了敲除HSF1的HEK-293TLuciferase細(xì)胞。利用上述藥物處理細(xì)胞,比較其Luciferase變化比率,相較于未敲除HSF1細(xì)胞,經(jīng)典HIV潛伏激活劑在敲除HSF1的細(xì)胞的Luciferase 比率在同一濃度下有下調(diào),而通過(guò)HSF1激活潛伏HIV的潛伏激活劑其Luciferase反而增加。表明HSF1是潛伏激活劑激活潛伏HIV的機(jī)制之一,但細(xì)胞內(nèi)仍有其他因子可替代HSFI作用于HSE從而發(fā)揮潛伏HIV激活的作用。為了探究HSF1的替代蛋白,我們檢測(cè)了與其相關(guān)的PARP1(poly ADP-ribose polymerase-1)蛋白,檢驗(yàn)了 PARP1激活潛伏HIV的能力,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、RT-qPCR、Western Blotting等方法,確定了 H2O2誘導(dǎo)的DNA損傷可以激活潛伏HIV,而應(yīng)用PARP1抑制劑后,其激活水平下降,同時(shí)H202無(wú)法下調(diào)敲除HSF1 的 HEK-293T-HSELuciferase細(xì)胞的 Luciferase強(qiáng)度。因此,PARP1 可能作為HIV潛伏細(xì)胞中HSF1的替代蛋白。綜上所述,HSF1可作為新型HIV潛伏感染激活劑研究的藥物靶點(diǎn),為下一步開(kāi)發(fā)以HSF1為靶點(diǎn)的特異性潛伏激活劑提供理論依據(jù),期望發(fā)現(xiàn)的化合物能清除HIV潛伏感染庫(kù),為最終實(shí)現(xiàn)功能性治愈提供新的藥物治療手段。
【圖文】：

途徑重新活化潛伏ＨＩＶ的潛伏感染激活劑。目前主要分為如下幾類(lèi)：逡逑１）免疫調(diào)節(jié)類(lèi)：主要有細(xì)胞因子組成，包括白介素家族的ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５逡逑以及ＣＤ３、ＣＤ２８抗體等，介導(dǎo)細(xì)胞的活化而促進(jìn)潛伏ＨＩＶ的活化［４１Ｌ逡逑２）轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)：①：通過(guò)激活劑蛋白激酶Ｃ邋（ＰＫＣ），促進(jìn)ＰＫＣ磷酸化，逡逑從而促進(jìn)其下游轉(zhuǎn)錄因子ＮＦ－ｋＢ和ＡＰ－］與病毒ＬＴＲ結(jié)合，介導(dǎo)病毒轉(zhuǎn)錄起始，逡逑代表藥物有Ｐｒｏｓｔｒａｔｉｎ、Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ等［４２，４３１；②：激活ｐ－ＴＥＦｂ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物活性，逡逑促進(jìn)Ｔａｔ蛋白與其結(jié)合共同促進(jìn)ＨＩＶ轉(zhuǎn)錄延伸，，代表藥物有ＪＱ１、ＨＭＢＡ等ｆ４４，４５］。逡逑３）表觀遺傳修飾類(lèi)：①組蛋白去乙�；敢种苿墒谷旧w中的核小體逡逑趨向于不穩(wěn)定狀態(tài)，暴露出纏繞在核小體上的病毒ＤＮＡ，促使ＨＩＶ轉(zhuǎn)錄的延伸逡逑從而激活ＨＩＶ的轉(zhuǎn)錄，代表藥物有ＳＡＨＡ邋（伏立諾他）、Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ等［４６４８］；逡逑②ＤＮＡ甲基化酶抑制劑，代表藥物有ＤｅＣｉｔａｂｉｎｅ［４１ｌ；③組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，代逡逑表藥物有邋Ｃｈａｅｔｏｃｉｎ［４９］。逡逑各類(lèi)潛伏激活劑胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如下圖：逡逑ＨＭＴｉｎＮｈｆｔｏｎ逡逑

碩士學(xué)位論文逡逑ＨＳＦ１與潛伏ＨＩＶ激活逡逑我們前期研宄發(fā)現(xiàn)，ＨＳＦ１與ＨＩＶ潛伏感染的激活相關(guān)。應(yīng)用應(yīng)激壓力誘導(dǎo)逡逑Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ、蛋白酶體抑制劑Ｃａｒｆｉｚｏｍｉｂ／Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ誘導(dǎo)潛伏ＨＩＶ激活，研宄逡逑ＨＳＦ１發(fā)生磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)募集ｐ３００促進(jìn)自身乙�；�，進(jìn)一步逡逑ＨＩＶＬＴＲ結(jié)合，誘導(dǎo)Ｈ１ＶＤＮＡ轉(zhuǎn)錄起始，同時(shí)，ＨＳＦ１還可募集ｐ－ＴＥＦｂ產(chǎn)逡逑轉(zhuǎn)錄延仲。進(jìn)－步研究發(fā)現(xiàn)，ＨＳＦ１可促進(jìn)下游ＨＳＰ９０的表達(dá)，從而保護(hù)了逡逑ＥＦｂ亞基ＣＤＫ９不發(fā)生發(fā)生泛素化降解，正反饋調(diào)節(jié)ＨＳＦ１的作用［５６，５７］。逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2589651