【摘要】：黑色素瘤(Melanoma)是臨床上較為常見的皮膚惡性腫瘤之一,其惡性程度較高、發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移早而廣泛,預(yù)后不良。近年來,黑色素瘤的發(fā)病率逐年升高,嚴(yán)重威脅著人類的健康。傳統(tǒng)的化療藥物選擇性低、毒性大,人體耐受性差。因此,開發(fā)新的具有高選擇性、高效低毒的黑色素瘤靶向治療藥物顯得尤為迫切。有研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinases,TPKs)在黑色素瘤中表達異常,這提示我們TPKs可能是一類新的黑色素瘤的治療靶點。TPKs是控制細胞增殖、遷移和凋亡的重要蛋白質(zhì),其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明50%以上的原癌基因和癌基因的產(chǎn)物都具有TPKs活性,TPKs異常表達會造成細胞增殖調(diào)節(jié)紊亂,進而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)以TPKs為靶點通過抑制細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲,并誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡,并在一定程度上克服了傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物選擇性差、不良反應(yīng)大等缺點,具有良好的應(yīng)用前景。但腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的、多因素的過程,抑制單一的信號傳導(dǎo)不足以遏制腫瘤的進程,如不能解決腫瘤干細胞等引起的腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的問題。腫瘤干細胞(Cancer stem cells,CSCs)即腫瘤內(nèi)“增殖性干細胞”,是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的根源,具有自我更新、多向分化、高致瘤性和耐藥性等特征。目前,對于惡性腫瘤的治療主要采取手術(shù)切除、放療和化療。盡管這些治療方法在很大程度上清除或殺滅了腫瘤組織和細胞,并延長了腫瘤患者的生存期,但是由于缺乏對CSCs的靶向性而無法真正解決腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良等問題,所以往往不能獲得最佳的治療效果。本文結(jié)合腫瘤細胞的信號傳導(dǎo)和腫瘤干細胞的生理特征,以達沙替尼(Dasatinib,DAS)和全反式維甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)為模型藥物,設(shè)計并制備基于DAS和ATRA的自組裝共給藥納米系統(tǒng),構(gòu)建抑制TPKs活性和殺傷CSCs的多功能靶向治療腫瘤策略,提高對腫瘤的治療療效,降低復(fù)發(fā)風(fēng)險。本文第一章主要闡述了DAS和ATRA共給藥抗黑色素瘤的研究背景及目的,為本課題提供理論支持。文本第二章以DAS為模型藥物,以小鼠黑色素瘤B16F10細胞株為體外模型,初步考察了DAS對黑色素瘤的體外作用。MTT實驗證實了DAS可以有效地抑制B16F10細胞的增殖,并呈劑量和時間依賴性。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示DAS對B16F10細胞的遷移能力有抑制作用。分別用低、中、高三個濃度的DAS處理B16F10細胞后,細胞形態(tài)發(fā)生改變,核裂解隨濃度增加而加劇,并形成凋亡小體,其細胞凋亡率分別為(34.06±0.83)%、(50.24±1.66)%和(88.91±0.96)%。本文第三章為了解決腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等問題,以DAS和ATRA為模型藥物,設(shè)計并制備了基于DAS和ATRA的自組裝共給藥納米粒(DAS/ATRA-NPs)。通過單因素試驗考察了DAS和ATRA的投藥量比、油相中乙醇和二氯甲烷體積比、油相與水相體積比及超聲時間對制備DAS/ATRA-NPs的影響,優(yōu)化了處方和制備工藝。透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy,TEM)下觀察到DAS/ATRA-NPs呈類橢球形,大小均一。用Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀測得DAS/ATRA-NPs的平均粒徑為(130.350±1.829)nm,多分散指數(shù)(PDI)為(0.247±0.013),Zeta電位為(26.617±0.939)m V。采用超濾法和超速離心法測得DAS和ATRA的包封率均達80%以上。在含10%乙醇的PBS釋放介質(zhì)中,DAS/ATRA-NPs中DAS和ATRA的釋放速率小于游離藥物,可見DAS/ATRA-NPs具有一定的緩釋效果。DAS/ATRA-NPs在4℃的儲存條件下放置一個月(30 d),其粒徑、PDI及Zeta電位均無明顯變化,未見聚集現(xiàn)象,穩(wěn)定性良好。本文第四章主要以小鼠黑色素瘤B16F10細胞為體外模型,對DAS/ATRA-NPs進行了體外細胞學(xué)評價。選用香豆素-6來標(biāo)記DAS/ATRA-NPs,通過流式細胞術(shù)檢測香豆素-6的熒光強度發(fā)現(xiàn)B16F10細胞對DAS/ATRA-NPs的攝取具有良好的量效和時效關(guān)系。激光共聚焦顯微鏡下觀察到香豆素-6標(biāo)記的DAS/ATRA-NPs主要定位在細胞的胞漿中。在細胞毒性實驗中,MTT實驗結(jié)果表明DAS和ATRA均能夠抑制B16F10細胞的增殖,且DAS/ATRA-NPs組的抑制作用強于DAS+ATRA組及ATRA組、DAS組,DAS/ATRA-NPs中DAS和ATRA產(chǎn)生了協(xié)同作用。利用細胞劃痕實驗及Transwell體外遷移實驗說明藥物處理后細胞的遷移性發(fā)生改變,DAS/ATRA-NPs能夠有效地抑制B16F10細胞的遷移,其趨勢與MTT結(jié)果相一致。細胞凋亡或死亡是腫瘤治療中重要的考察因素,用DAPI染色液染核后發(fā)現(xiàn),藥物處理后的細胞出現(xiàn)了明顯的染色質(zhì)固縮、核膜破裂、核裂解等現(xiàn)象。流式細胞儀定量分析結(jié)果同樣說明了這個問題,DAS/ATRA-NPs可以誘導(dǎo)B16F10細胞的凋亡并促進細胞的死亡。其細胞凋亡和死亡率顯著的高于DAS+ATRA組及ATRA組、DAS組(P0.05)。接著,本章對DAS/ATRA-NPs中DAS和ATRA的協(xié)同機制進行了初步考察。細胞球囊形成實驗和側(cè)群細胞實驗是兩種常用的體外檢測干細胞的手段。細胞球囊形成實驗結(jié)果顯示B16F10細胞能夠在一定條件下形成細胞球囊,具有較強的致瘤性和類CSCs樣特性。DAS/ATRA-NPs能夠抑制細胞球囊的形成,且抑制作用強于其他組別。側(cè)群細胞實驗結(jié)果與細胞球囊形成實驗結(jié)果一致,DAS/ATRA-NPs能夠顯著地抑制B16F10細胞的類CSCs樣特性,且效果優(yōu)于陽性對照維拉帕米。DAS可以抑制SRC激酶的磷酸化,用Western blot檢測藥物處理后SRC P-Y418和SRC的表達水平,結(jié)果顯示SRC P-Y418受到藥物調(diào)控表達水平下調(diào),且DAS/ATRA-NPs組的SRC P-Y418表達量明顯小于其他組別。以上實驗說明DAS/ATRA-NPs能通過抑制類CSCs樣特性和SRC激酶的磷酸化發(fā)揮協(xié)同抗黑色素瘤的作用。本文第五章主要考察了DAS/ATRA-NPs的體內(nèi)分布情況。以5×106個細胞量腋下接種裸鼠,建立皮下異位腫瘤模型。用Di D熒光標(biāo)記DAS/ATRA-NPs,尾靜脈注射考察DAS/ATRA-NPs在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布情況,IVIS Spectrum活體動物成像系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示熒光主要分布在肝臟、脾臟及皮下異位腫瘤中。分別于2 h和24 h處死荷瘤裸鼠并解剖取出腫瘤,進行冰凍切片。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)DAS/ATRA-NPs組的腫瘤組織中Di D紅色熒光更強,說明DAS/ATRA-NPs易被腫瘤細胞攝取并在腫瘤中富集,具有一定的腫瘤靶向性。24 h后腫瘤組織中DiD紅色熒光減弱。綜上所述,本文探索了新的腫瘤靶向治療方式,在理論上豐富了腫瘤細胞治療的研究內(nèi)容,所構(gòu)建的自組裝共給藥納米系統(tǒng)具有多功能抗腫瘤的特性,有望為腫瘤的靶向治療提供新的思路。
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文和空白對照孔。分別培養(yǎng) 24 h 和 48 h 后，每孔加入 10 μL 續(xù)于 37 ℃孵育 4 h。然后棄上清，每孔加入 150 μL DMSO 使標(biāo)儀測定 490 nm 處的光密度 OD 值。按照下列公式計算：尼作用B16F10細胞24 h和48 h后均對細胞增殖活力產(chǎn)生明顯隨著藥物濃度的增大而增強，呈劑量依賴性。達沙替尼作用 4 后的細胞存活率均減小，且具有顯著性差異（P < 0.05），這說延長達沙替尼的作用時間可以增強其對 B16F10 細胞的增殖抑

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文落的細胞 2 - 3 次。分別用含低、中、高濃度（6.25、12.5、25 μg/mL）的達沙替尼培養(yǎng)液處理 B16F10 細胞 24 h，，陽性對照組和空白對照組分別加入等量含 12.5 μg/mL 紫杉醇的培養(yǎng)液和不含藥的培養(yǎng)液作用細胞 24 h。分別于藥物處理的 0 h 和 24 h 拍照觀察達沙替尼對細胞遷移能力的影響。空白對照組中劃痕邊緣的 B16F10 細胞向劃痕中心處遷移使“劃痕”愈合（圖 1-2 A）。藥物處理后 B16F10 細胞的遷移受到了明顯的抑制（圖 1-2 B），紫杉醇組和低濃度（6.25 μg/mL）的達沙替尼組僅有少量細胞發(fā)生遷移，中和高濃度（12.5 和 25 μg/mL）的達沙替尼組基本無細胞遷移行為。A
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R943

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 趙劍平;尹培;劉春海;呂佰瑞;柴鵬;;Src激酶抑制劑ZD6474在乳腺癌MCF-7細胞轉(zhuǎn)移中的作用和機制[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2016年01期

2 喬明曦;張曉君;巴爽;胡海洋;趙秀麗;陳大為;;腫瘤干細胞靶向給藥系統(tǒng)的研究進展[J];藥學(xué)學(xué)報;2013年04期

3 王林;張振東;解海;李大祥;張樂;孫敬巖;;Src激酶抑制劑PP2在乳腺癌MCF-7細胞轉(zhuǎn)移中的作用和機制[J];中國腫瘤臨床;2013年05期

4 李然;寧華;張艷華;;小分子酪氨酸激酶抑制劑研究進展[J];中國醫(yī)院用藥評價與分析;2012年02期

5 曾寶;王春玲;吳安國;李生梅;江瑞榮;賴小平;;Caco-2細胞模型的建立及其在中藥吸收研究中的應(yīng)用探討[J];中藥新藥與臨床藥理;2010年06期

6 張潔;王鴻程;;Src及其抑制劑對非小細胞肺癌作用的研究進展[J];國際內(nèi)科學(xué)雜志;2009年01期

7 杜軍;戈應(yīng)濱;顧洛;;Src激酶抑制劑PP2對乳腺癌MDA-MB-231細胞黏附、遷移能力的影響[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2008年07期

8 雷伯開;金方;;Calu-3細胞模型在吸入制劑研究中的應(yīng)用[J];中國藥學(xué)雜志;2008年03期

9 蔣學(xué)華,賈運濤,袁媛,陳鈞,周靜;Caco-2細胞模型在口服藥物吸收過程研究中的應(yīng)用[J];中國藥學(xué)雜志;2002年05期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李虎;抗腫瘤藥物達沙替尼類似物的合成及抗腫瘤活性研究[D];東華大學(xué);2010年

本文編號：2579531