【摘要】：線粒體疾病是由線粒體基因或核基因突變、線粒體膜或蛋白質(zhì)受損引起的疾病。其主要影響患者腦,肌肉和心臟等組織。目前尚無特效藥,現(xiàn)有治療藥物均是對癥治療。有文獻(xiàn)報道,從線粒體功能障礙的源頭出發(fā),修復(fù)胞內(nèi)突變基因,清除胞質(zhì)蛋白積累毒性是治療線粒體疾病的根本方法。但其可能存在實現(xiàn)難度較大,價格昂貴,副作用風(fēng)險未知,進(jìn)入臨床應(yīng)用困難等諸多問題。因此,本研究提出了用具有生物活性的線粒體替代功能障礙線粒體的治療策略,制備了一種簡便的線粒體注射劑用以探究同源線粒體對線粒體功能障礙性肝損傷小鼠的治療作用。本研究中以小鼠對乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)急性肝損傷模型和高脂性脂肪肝模型作為研究線粒體對功能障礙性肝臟疾病模型的治療作用。本研究中同源線粒體取自昆明小鼠肝臟。所提取的線粒體形狀良好,所制備的線粒體注射劑狀態(tài)良好。JC-1測得了膜電位ΔΨm正常。使用線粒體選擇性探針MitoTracker Red CMXRos染色,線粒體表現(xiàn)出明顯的紅色熒光,證明所制備線粒體注射劑中線粒體完整性良好。同時測定了實驗所制備線粒體注射劑的穩(wěn)定性。結(jié)果表明制備的線粒體制劑可用于進(jìn)一步實驗。MitoTracker Red CMXRos染色線粒體與綠色熒光蛋白(enhanced cyan fluorescent protein,ECFP)標(biāo)記線粒體(ECFP-Mito)經(jīng)尾靜脈注入正常小鼠體內(nèi)。通過小動物活體成像儀確定MitoTracker Red CMXRos染色線粒體與ECFP-Mito線粒體在小鼠全身均有分布。再將小鼠各器包括腦、肺、肝臟、腎、心、脾、肌肉做冷凍切片。共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,LSCM)拍照觀察確定了MitoTracker Red CMXRos染色線粒體與ECFP-Mito線粒體在細(xì)胞內(nèi)均有分布。選取健康雄性昆明小鼠60只隨機分成5組,其中4組分別注射8 mg/kg劑量的線粒體作為實驗組,第5組注射等量的0.01 M PBS作為正常對照組。線粒體注射組分別在1 h、8 h、24 h、72 h后水合氯醛麻醉,取腦、心、肝、腎、肌肉組織勻漿,分別測定各組織中腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的含量。結(jié)果證明8 mg/kg這一注射劑量對小鼠無明顯生理毒性,可作為常用注射劑量。小鼠自發(fā)活動實驗與游泳實驗進(jìn)一步證實了這一劑量的可行性。把所得帶有綠色熒光蛋白ECFP的線粒體配成0.2 mg/mL的注射劑尾靜脈注射到兩只正常小鼠體內(nèi),2 h后處死,將肝細(xì)胞分離,流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞ECFP-Mito的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明線粒體進(jìn)入了多種組織細(xì)胞。在線粒體對APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠的治療實驗中,將實驗?zāi)Ｐ褪箅S機分成兩組,每組12只,另設(shè)等量正常對照組。其中一組APAP肝損傷模型組小鼠尾靜脈注射0.8 mg/m L線粒體注射劑10 mL/kg,為治療組,其余兩組注射等量0.01 M PBS。12 h后取血和肝臟分別測定各小鼠血清測得治療組谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和肝臟腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的量,再將各組肝臟做蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色和透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)拍照。結(jié)果證明,在APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷模型研究中,治療組小鼠AST、ALT、ATP、ROS、GSH的量與模型組和對照組相比存在顯著性差異。HE染色顯示模型組有較嚴(yán)重的浸潤性損傷,治療組小鼠較模型組小鼠肝損傷有很大改善。TEM圖片顯示,模型組線粒體均一致接近圓球形,而治療組和同對照組相似的短桿狀線粒體。在線粒體對高脂性脂肪肝模型小鼠的治療實驗中,治療組每兩天注射一次線粒體注射劑,共3次。余下兩組每兩天注射一次PBS,共3次。第6天分別測定各小鼠血清中AST、ALT、總膽固醇(total cholesterol,TC)和肝臟ATP、GSH、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、甘油三酯(triglycerides,TG)的量,再將各組肝臟做HE染色,油紅O以及Mayer氏蘇木素染色。測得治療組小鼠AST、ALT、TC、ATP、GSH、SOD、MDA的量與模型組和對照組相比存在顯著性差異;HE染色,油紅O以及Mayer氏蘇木素染色所得結(jié)果證明尾靜脈注射線粒體對高脂性脂肪肝具有一定的改善效果。綜上所述,本研究制備的線粒體注射劑經(jīng)尾靜脈注射后線粒體能夠進(jìn)入小鼠組織細(xì)胞內(nèi),且對小鼠無明顯生理毒性。同時對小鼠APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠和高脂性脂肪肝模型小鼠具有較好的改善效果。線粒體替代治療可能是一種治療線粒體功能障礙性肝損傷的新方法,從而為線粒體疾病的治療提供一種新思路。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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1 曾志華;馮雯琪;卓廉士;;電針對非酒精性脂肪肝肝細(xì)胞色素P450 2E1表達(dá)及氧化抗氧化的影響[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2008年11期

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本文編號：2579288