【摘要】：目的建立氫化可的松聯(lián)合rmIL-2、rmIL-15體外擴(kuò)增小鼠NK細(xì)胞的方法 ,觀察該培養(yǎng)方法對擴(kuò)增后NK細(xì)胞的純度、擴(kuò)增效率及功能的影響。方法應(yīng)用免疫磁珠分選法(MACS)分離得到高純度的小鼠脾臟CD3-CD49b+NK細(xì)胞,依據(jù)添加刺激因子的不同將純化后的NK細(xì)胞分成A組(rmIL-2)、B組(rmIL-2+rmIL-15)和C組(氫化可的松+rmIL-2+rmIL-15)進(jìn)行體外培養(yǎng),每3日添加新鮮培養(yǎng)基及細(xì)胞刺激因子。采用臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù);流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3-CD49b+NK細(xì)胞純度;CFSE稀釋法檢測NK細(xì)胞的增殖效率;MTT比色法檢測NK細(xì)胞殺傷活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞膜表面CD107a的表達(dá)。結(jié)果磁珠分選后NK細(xì)胞純度由分選前的(8.59±1.41)%提高為分選后的(91.60±1.33)%。體外擴(kuò)增培養(yǎng)15 d后A組擴(kuò)增的NK細(xì)胞純度降低[(75.02±3.48)%,P0.01],B組(85.87±4.79)%和C組(88.04±3.35)%與擴(kuò)增前相比較無明顯差異(P0.05)。擴(kuò)增15 d后C組NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為(45.06±1.64)倍,顯著高于A組(5.28±0.34,P0.01)和B組(25.39±3.29,P0.05)。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明培養(yǎng)第7天和第14天各組NK細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)分別為A組(2.26±0.81)和(3.27±1.21),B組(4.62±1.45)和(15.82±3.92),C組(6.91±1.34)和(23.66±5.42)。培養(yǎng)第7天和第14天NK細(xì)胞增殖指數(shù)C組B組A組(P0.05)。當(dāng)效靶比為10∶1時,C組擴(kuò)增后NK細(xì)胞腫瘤殺傷率為(81.27±2.32)%,顯著高于A組[(37.20±7.32)%,P0.01]和B組[(69.51±6.32)%,P0.05]擴(kuò)增后NK細(xì)胞。C組(49.32±4.36)%擴(kuò)增后NK細(xì)胞CD107a表達(dá)水平顯著高于A組[(9.37±1.82)%,P0.001]和B組[(28.46±4.21)%,P0.01)]NK細(xì)胞。結(jié)論氫化可的松聯(lián)合rmIL-2+rmIL-15培養(yǎng)方案能夠有效地體外擴(kuò)增并活化小鼠NK細(xì)胞,為NK細(xì)胞的腫瘤過繼免疫治療應(yīng)用于臨床奠定了實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

細(xì)胞(5×103個)按照不同比例混合均勻培養(yǎng)與96孔板中，置入37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。4h后通過MTT比色法檢測NK細(xì)胞腫瘤殺傷活性。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)效靶比為10∶1時，C組擴(kuò)增后NK細(xì)胞腫瘤殺傷率為(81.27±2.32)%，顯著高于經(jīng)A組[(37.20±7.32)%，，P＜0.01]和B組[(69.51±6.32)%，P＜0.05]擴(kuò)增后NK細(xì)胞(圖4)�！鱌＜0.01,vsbeforeseparation.a)ThepurityofNKcellsexpandedingroupA;b)thepurityofNKcellsexpandedingroupB;c)thepurityofNKcellsexpandedingroupC.▲P＜0.01，茛P>0.05,vsafterseparation.圖1NK細(xì)胞純度Fig1ThepurityofNKcellsbeforeandafterseparation*P＜0.01,vsgroupA;▲P＜0.05,vsgroupB.圖2不同方案體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的倍數(shù)Fig2TheamplificationofNKcellsexpandedinthreegroups·568·

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