【摘要】：神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)元損傷是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病。此類(lèi)疾病的預(yù)后與神經(jīng)細(xì)胞的存活、神經(jīng)元分化和功能恢復(fù)密切相關(guān),亦與相關(guān)基因表達(dá)的激活或抑制有關(guān)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ(TopoisomeraseⅡβ,TopoⅡβ)是促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元分化的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的一種活性生物堿,化學(xué)名2,3,5,6-四甲基吡嗪。最近有研究報(bào)道了其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化有促進(jìn)作用,但其確切作用機(jī)制尚不明了。本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞為神經(jīng)元分化模型,用TMP誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化,并檢測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程中TopoⅡβ的表達(dá)變化;進(jìn)而探討TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的分子機(jī)制。為T(mén)MP在神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)研究與治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。本研究共分三部分。第一部分川芎嗪對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)特性的影響和神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)作用目的:研究TMP對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響,以及誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化的作用。方法:1、細(xì)胞培養(yǎng):SH-SY5Y細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基,置飽和濕度和37℃于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、MTT法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞體外增殖活性,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。3、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放實(shí)驗(yàn):不同濃度的TMP處理1~5天,測(cè)定LDH釋放百分率評(píng)價(jià)TMP的細(xì)胞毒性。4、細(xì)胞周期和凋亡率檢測(cè):分別在TMP作用0,3和5天收集細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞百分比,并檢測(cè)凋亡率。5、細(xì)胞核DAPI染色:分別在TMP作用0,1,3和5日進(jìn)行DAPI染色,觀察細(xì)胞核形態(tài)。6、Caspase-3活性檢測(cè):SH-SY5Y細(xì)胞以80μmol/L TMP作用0,1,3和5天后收集細(xì)胞,檢測(cè)樣品Caspase-3的活性。7、細(xì)胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測(cè):不同濃度的TMP誘導(dǎo)分化,分別在0~5天觀察、測(cè)量各組細(xì)胞突起長(zhǎng)度的變化。以單個(gè)細(xì)胞總突起長(zhǎng)度大于100μm作為細(xì)胞分化標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算細(xì)胞分化百分率。8、免疫印跡(Western blot)檢測(cè)神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白MAP2、tau的表達(dá)和p21蛋白的表達(dá)。9、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示,單因素方差分析(One-Way ANOVA),P0.05為有顯著性意義。結(jié)果： 1 MTT檢測(cè)TMP對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞體外增殖的影響在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),20μmol/L TMP對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響(P0.05)。細(xì)胞分別在40,80,120,160,320和400μmol/L TMP作用下,增殖受到抑制(P0.05)。隨著TMP濃度的增高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制逐漸增加。提示TMP對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。2 LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMP的細(xì)胞毒性40,80和120μmol/L TMP分別處理SH-SY5Y細(xì)胞。在1、3和5天檢測(cè)LDH釋放百分率,與對(duì)照細(xì)胞比較,均顯示無(wú)明顯差異(P0.05)。160μmol/L TMP作用5天LDH釋放比率分別為16.1±1.50%,和對(duì)照組11.2±1.20%相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。240μmol/L TMP作用1、3和5天,LDH釋放比率分別為14.5±2.00%,16.6±2.00%,19.5±3.32%,對(duì)照組分別為11.7±1.34%,11.1±1.56,11.2±1.20%,有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。上述結(jié)果表明,低濃度TMP(40,80和120μmol/L)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性。3 TMP對(duì)細(xì)胞周期分布和凋亡的影響SH-SY5Y細(xì)胞在80μmol/L處理0、3和5天,與對(duì)照組細(xì)胞相比較G0/G1期細(xì)胞增多,表明發(fā)生G0/G1期阻滯(P0.05)。與對(duì)照細(xì)胞向比,TMP可引起細(xì)胞周期抑制因子(G0/G1抑制蛋白)p21蛋白的表達(dá)升高(P0.05)。80μmol/L TMP處理細(xì)胞在0,1,3和5天,檢測(cè)2倍體峰前均未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡峰;DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài),細(xì)胞核表現(xiàn)形態(tài)完整,均未見(jiàn)凋亡小體等凋亡特征性改變。TMP處理后,Caspase-3活性和active-Caspase-3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05)。顯示80μmol/L TMP在誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)元分化中未導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。4細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)變化和分化百分率TMP誘導(dǎo)組細(xì)胞出現(xiàn)增殖速度下降,細(xì)胞逐漸伸出突起;且突起的數(shù)量和長(zhǎng)度明顯增加。對(duì)單個(gè)細(xì)胞平均神經(jīng)突起長(zhǎng)度測(cè)量,結(jié)果顯示:在20μmol/L TMP作用下,SH-SY5Y細(xì)胞突起長(zhǎng)度和分化百分率改變不明顯(P0.05)。而40μmol/L誘導(dǎo)2天,細(xì)胞突起開(kāi)始出現(xiàn)明顯增長(zhǎng),與對(duì)照細(xì)胞比較有顯著性差異(P0.05)。80μmol/L和120μmol/L TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞后,細(xì)胞神經(jīng)突起長(zhǎng)度和分化百分率均較對(duì)照細(xì)胞明顯增長(zhǎng),且均比40μmol/L誘導(dǎo)后突起長(zhǎng)度增加明顯(P0.05)。5神經(jīng)元分化的鑒定采用神經(jīng)元分化標(biāo)志分子,微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)和tau蛋白鑒定神經(jīng)元分化。SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)80μmol/L TMP誘導(dǎo)0,3和5日后MAP2和tau蛋白表達(dá)增高,與對(duì)照組細(xì)胞相比有明顯差異(P0.05)。結(jié)論:80μmol/L TMP誘導(dǎo)可使SH-SY5Y細(xì)胞脫離細(xì)胞周期,并向神經(jīng)元分化;且未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性。因此,本研究選用80μmol/L TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化,并繼續(xù)用于后繼機(jī)制研究。第二部分川芎嗪上調(diào)TopoⅡβ誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制目的:檢測(cè)TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化過(guò)程中,TopoⅡβ的表達(dá)變化及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制。方法:1、細(xì)胞培養(yǎng):SH-SY5Y細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基,置飽和濕度和37℃于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、細(xì)胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測(cè):用80μmol/L TMP誘導(dǎo)分化,分別在0~5天觀察和測(cè)量細(xì)胞平均突起長(zhǎng)度,以單個(gè)細(xì)胞突起總長(zhǎng)度大于100μm作為細(xì)胞分化標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算細(xì)胞分化百分率。3、Western blot檢測(cè)TopoⅡα、TopoⅡβ、組蛋白H3、H4、乙酰化組蛋白H3(acetylated histone H3,Ac-H3)和乙�；M蛋白H4(acetylated histone H4,Ac-H4)的表達(dá)。4、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)TopoⅡβm RNA表達(dá)。5、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)檢測(cè)Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)的募集與結(jié)合。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:同第一部分。結(jié)果:1 Western blot檢測(cè)TopoⅡβ和TopoⅡα蛋白的表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞比較,TMP誘導(dǎo)分化細(xì)胞的TopoⅡα蛋白表達(dá)在第3天和第5天均明顯減少(P0.05);而TopoⅡβ蛋白表達(dá)則明顯增加(P0.05)。2 RT-PCR檢測(cè)TopoⅡβmRNA表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞相比,TopoⅡβm RNA的表達(dá)在TMP誘導(dǎo)分化的第3天和第5天均表現(xiàn)為增加(P0.05)。3 ICRF-193拮抗TMP誘導(dǎo)TopoⅡβ表達(dá)和神經(jīng)元分化TopoⅡβ抑制劑ICRF-193作用后,TopoⅡβ和MAP2蛋白表達(dá)受到抑制(P0.05);神經(jīng)突起數(shù)量和長(zhǎng)度均明顯下降(P0.05)。表明TopoⅡβ與神經(jīng)元分化呈正相關(guān)。4 TMP誘導(dǎo)組蛋白H3和H4出現(xiàn)過(guò)乙酰化Ac-H3的表達(dá)在TMP誘導(dǎo)分化的第3天和第5天逐漸增加(P0.05);而Ac-H4的表達(dá)在TMP誘導(dǎo)分化的第5天明顯增加(P0.05)。提示Ac-H3與Ac-H4均可被TMP誘導(dǎo)表達(dá),而Ac-H3表達(dá)升高相對(duì)較早。5 TMP增強(qiáng)Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合著誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng),特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)的Ac-H3與Ac-H4逐漸增高(P0.05)。Ac-H3在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合早于Ac-H4。提示Ac-H3發(fā)揮作用早于Ac-H4。結(jié)論:TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化作用與TopoⅡβ表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。TMP促進(jìn)Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)的募集而誘導(dǎo)TopoⅡβ高表達(dá),是促進(jìn)神經(jīng)元分化的重要機(jī)制。第三部分PI3K/Akt信號(hào)通路參與川芎嗪誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)元分化目的:探討TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中,PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)通路對(duì)TopoⅡβ表達(dá)和神經(jīng)元分化的影響及機(jī)制。方法:1、細(xì)胞培養(yǎng):SH-SY5Y細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基,置飽和濕度和37℃于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、細(xì)胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測(cè):用80μmol/L TMP誘導(dǎo)細(xì)胞分化。分別在0~5天測(cè)量計(jì)算細(xì)胞平均突起長(zhǎng)度,以單個(gè)細(xì)胞總突起長(zhǎng)度大于100μm作為分化標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算細(xì)胞分化百分率。3、Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。4、RT-PCR檢測(cè)TopoⅡα和TopoⅡβm RNA表達(dá)。5、Ch IP檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1與NF-YA在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:同第一部分。結(jié)果:1 TMP對(duì)p-Akt、p-ERK1/2、TopoⅡα、TopoⅡβ、Sp1和NF-YA蛋白表達(dá)的影響80μmol/L TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化0,1,3和5天。TopoⅡα蛋白的表達(dá)逐漸減少,TopoⅡβ蛋白表達(dá)逐漸增多;p-Akt的表達(dá)逐漸升高(P0.05),p-ERK1/2表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05);Sp1的表達(dá)逐漸增高(P0.05),而NF-YA蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05)。2 PI3K/Akt抑制劑LY294002對(duì)p-Akt,TopoⅡα、β、Sp1和NF-YA蛋白表達(dá)的影響應(yīng)用LY294002后,80μmol/L TMP誘導(dǎo)細(xì)胞分化5天,TopoⅡα蛋白的表達(dá)減少,且不受LY294002的影響;TopoⅡβ和Sp1蛋白表達(dá)和p-Akt的表達(dá)受到明顯抑制(P0.05)。p-ERK1/2和NF-YA蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05)。3 LY294002抑制TMP誘導(dǎo)的神經(jīng)突起的發(fā)生和神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)TMP誘導(dǎo)第5天,應(yīng)用LY294002后,TMP誘導(dǎo)細(xì)胞的突起長(zhǎng)度由150.97±6.62μm下降為91.80±7.82μm(P0.05),細(xì)胞分化百分率由80.04±3.26%下降為46.20±33.56%(P0.05)。而MEK/ERK抑制劑U0126對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞突起長(zhǎng)度和分化百分率均未產(chǎn)生明顯作用(P0.05)。經(jīng)LY294002處理細(xì)胞后,神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白MAP2的表達(dá)受到明顯抑制(P0.05)。而U0126對(duì)MAP2蛋白表達(dá)未產(chǎn)生明顯抑制作用。表明PI3K/Akt信號(hào)通路參與了TMP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞分化。4 LY294002對(duì)TMP誘導(dǎo)TopoⅡα和TopoⅡβm RNA表達(dá)的影響TMP可上調(diào)TopoⅡβm RNA的表達(dá),而抑制TopoⅡαm RNA的表達(dá)。與TMP誘導(dǎo)組相比較,加入PI3K/Akt抑制劑LY294002作用后,TopoⅡβm RNA的表達(dá)下調(diào)(P0.05),而TopoⅡαm RNA的表達(dá)無(wú)明顯改變(P0.05)。分別應(yīng)用蛋白質(zhì)合成抑制劑亞胺環(huán)己酮(Cycloheximide,CHX)和RNA聚合酶II抑制劑鵝膏菌素(α-amanitin)預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞后檢測(cè)TopoⅡβm RNA的表達(dá),結(jié)果顯示:α-amanitin(50μg/m L)可明顯降低TMP誘導(dǎo)的TopoⅡβm RNA的表達(dá),而CHX(10 mmol/L)則對(duì)其表達(dá)無(wú)明顯影響。表明TMP上調(diào)TopoⅡβ的表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,并且與PI3K/Akt信號(hào)途徑的激活有關(guān)。5 TMP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Sp1和NF-YA在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合Ch IP檢測(cè)顯示,TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中,Sp1蛋白特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子GC盒,促進(jìn)了TopoⅡβ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002作用后,結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)的Sp1蛋白受到明顯抑制(P0.05)。轉(zhuǎn)錄因子NF-Y的亞型NF-YA在神經(jīng)分化后期與TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合也呈現(xiàn)增高(P0.05),而LY294002對(duì)NF-YA與TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合沒(méi)有明顯影響(P0.05)。結(jié)果提示PI3K/Akt/Sp1/TopoⅡβ信號(hào)途徑參與了TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化。結(jié)論:TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化過(guò)程中,PI3K/Akt信號(hào)被激活;轉(zhuǎn)錄因子Sp1受到PI3K/Akt通路的調(diào)控;Sp1與TopoⅡβ基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,促進(jìn)TopoⅡβ基因的轉(zhuǎn)錄激活。PI3K/Akt/Sp1/TopoⅡβ信號(hào)途徑參與了TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R96
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本文編號(hào)：2562870