【摘要】：目的制備靶向輸送針對核糖核苷酸還原酶RR小亞基M2(RRM2)的siRNA(RRM2-siRNA)的聚N-異丙基丙烯酰胺/聚乙烯亞胺(PNIPAM/PEI)納米凝膠,通過研究其體外的抗腫瘤效應(yīng),以期構(gòu)建新型靶向納米凝膠遞送基因系統(tǒng)。方法采用自由基接枝共聚合(radical graft copolymerization)反應(yīng)制備具有"核-殼"結(jié)構(gòu)的PNIPAM/PEI聚陽離子溫度敏感型納米凝膠,評價其粒徑、zeta電位等理化性質(zhì);根據(jù)電荷相互作用原理,并通過偶聯(lián)抗人表皮生長因子受體2(Her2)抗體,形成包裹RRM2-siRNA的靶向性PNIPAM/PEI-siRNA納米凝膠復(fù)合體。利用凝膠電泳確定PNIPAM/PEI-siRNA納米凝膠復(fù)合體包裹siRNA效果,通過熒光顯微鏡定性觀察和流式細(xì)胞術(shù)定量檢測人胃癌細(xì)胞NCI-N87對該納米凝膠復(fù)合體的攝取情況,利用qPCR法檢測該納米凝膠遞送siRNA后靶基因RRM2的表達情況,用Transwell法檢測該納米凝膠復(fù)合體對NCI-N87細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果本研究合成具有"核-殼"結(jié)構(gòu)的溫度敏感型PNIPAM/PEI納米凝膠,顆粒均勻,粒徑為359.8nm,zeta電位為21.4mV。在此基礎(chǔ)上,我們制備出靶向凝膠包裹RRM2-siRNA的納米凝膠復(fù)合體,確定最佳包裹比例為N/P=60(N/P:聚陽離子納米凝膠中氨基與質(zhì)粒DNA中磷酸基的摩爾比)。不同溫度下(37℃、42℃)細(xì)胞內(nèi)吞實驗證實,該納米凝膠復(fù)合體具有良好的靶向性和溫度響應(yīng)性,且可以下調(diào)靶基因RRM2的表達,抑制NCI-N87細(xì)胞的遷移。結(jié)論成功制備抗體靶向的PNIPAM/PEI聚陽離子溫度敏感型納米凝膠,其可以結(jié)合并投遞siRNA進入靶細(xì)胞,該納米復(fù)合體可以作為新型抗腫瘤基因治療的給藥系統(tǒng)。
【圖文】：

第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報２０１７年６月，第３８卷圖２納米凝膠的粒徑分布（Ａ）及電位大�。ǎ拢疲椋纾玻校幔颍簦椋悖欤澹螅椋澹洌椋螅簦颍椋猓酰簦椋铮睿ǎ粒幔睿洌澹簦幔穑铮簦澹睿簦椋幔欤ǎ拢铮妫睿幔睿铮纾澹靾D３不同Ｎ／Ｐ的包裹ｓｉＲＮＡ聚陽離子納米凝膠的電泳結(jié)果（Ａ）和酶切保護與釋放結(jié)果（Ｂ）Ｆｉｇ３Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Ａ）ａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｌｅａｓｅ（Ｂ）ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｉＲＮＡｓｐａｃｋｅｄｉｎｎａｎｏｇｅｌｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔＮ／ＰｒａｔｉｏｓＩｎＦｉｇ３Ａ，Ｍ：ＮａｋｅｄｓｉＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌ；１：Ｎ／Ｐ＝５；２：Ｎ／Ｐ＝１５；３：Ｎ／Ｐ＝３０；４：Ｎ／Ｐ＝６０；５：Ｎ／Ｐ＝７５；６：Ｎ／Ｐ＝１２０．ＩｎＦｉｇ３Ｂ，Ｍ：ＮａｋｅｄｓｉＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌ；１：Ｎ／Ｐ＝７５；２：Ｎ／Ｐ＝６０；３：Ｎ／Ｐ＝３０；ａ：ＳａｍｐｌｅｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＲＮａｓｅ；ｓ：Ｓａｍｐｌｅｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｅｐａｒｉｎ．Ｎ／Ｐ：Ｒａｔｉｏｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｒｏｍ－ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃｎａｎｏｇｅｌｔｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｆｒｏｍ－ＤＮＡｏｆｐｌａｓｍｉｄ２．３靶向納米凝膠復(fù)合體的細(xì)胞內(nèi)吞結(jié)果采用定性和定量的方法研究納米粒子的體外細(xì)胞攝取，圖４Ａ為熒光顯微鏡觀察ＮＣＩ－Ｎ８７細(xì)胞對靶向納米凝膠復(fù)合體的內(nèi)吞結(jié)果，由圖可見，ＦＡＢ－ｎａｎｏｇｅｌ組隨著培養(yǎng)溫度的增加細(xì)胞內(nèi)吞的靶向納米凝膠復(fù)合體的熒光增強，高于ＢＳ

第６期．張莉，，等．主被動雙靶向納米凝膠遞送ＲＲＭ２－ｓｉＲＮＡ的體外抗腫瘤效應(yīng)ｓｉＲＮＡ的靶向納米凝膠復(fù)合體可以使ＲＲＭ２基因表達降低，且具有溫度響應(yīng)性（在４２℃時下調(diào)較３７℃更明顯，Ｐ＜０．０５）。圖５體外實驗檢測ＲＲＭ２沉默效率Ｆｉｇ５ＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＲＲＭ２ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｎａｎｏｇｅｌ－ｓｉＲＮＡｃｏｍｐｌｅｘｉｎＮＣＩ－Ｎ８７ｃｅｌｌｓＲＲＭ２：ＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｓｕｂｕｎｉｔＭ２．＊Ｐ＜０．０５ｖｓｎｅｇ－ｓｉＲＮＡｇｒｏｕｐ；△Ｐ＜０．０５ｖｓ３７℃．ｎ＝３，ｘs

本文編號：2555324