【摘要】：目的： ADMA是心血管疾病的風(fēng)險因素,其主要代謝酶DDAHA被認(rèn)為是心血管疾病治療的重要靶點。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)人類DDAH1存在3個轉(zhuǎn)錄本,但只有其中DDAH1-V1與ADMA代謝相關(guān)。本文旨在研究辛伐他汀對DDAH1的三個不同轉(zhuǎn)錄mRNA表達的影響及其機制,為探討DDAH1不同轉(zhuǎn)錄本在辛伐他汀反應(yīng)性及不同轉(zhuǎn)錄本的功能奠定基礎(chǔ)。 方法： (1)Transwell小室實驗測定辛伐他汀對ADMA處理的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響：細(xì)胞分為DMSO(對照)組、ADMA(3μM)處理組、ADMA(3μM)+辛伐他汀(1μM)處理組和辛伐他汀(1μM)處理組。細(xì)胞應(yīng)用DMSO(對照組)或ADMA(3μM)處理24h,ADMA(3μM)+辛伐他汀(1μM)處理組和辛伐他汀(1μM)處理組先用1μM辛伐他汀預(yù)處理6h,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Transwell小室上室,24h后測定小室對側(cè)遷移的細(xì)胞數(shù)目,以評估內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。 (2)觀察辛伐他汀對原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DDAH1轉(zhuǎn)錄本表達的影響：原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分別應(yīng)用DMSO(溶劑對照組)或低、中、高濃度(0.2μM、1μM、2μM)的辛伐他汀處理12h和24h,提取總RNA和總蛋白,采用Real-time PCR的方法檢測DDAH1的三個轉(zhuǎn)錄本mRNA表達,western-blot檢測DDAHl-V1蛋白表達。 (3)觀察辛伐他汀對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DDAHI轉(zhuǎn)錄本mRNA穩(wěn)定型的影響：人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株分別加用(處理組)或不加(對照組)辛伐他汀(1μM、2μM)預(yù)處理2h后,加入放線菌素D(ActD,2.5μg/ml)進行處理,并在加入ActD后Oh、1h、2h、4h、8h和12h收集細(xì)胞,提取總RNA,采用Real-time PCR法檢測DDAHI的三個轉(zhuǎn)錄本mRNA的表達。 結(jié)果： (1)與對照組相比,3μM ADMA處理可顯著促進內(nèi)皮細(xì)胞遷移(1.30±0.30vs1±0.00,P=0.012),中濃度的辛伐他汀單獨處理對內(nèi)皮細(xì)胞遷移無顯著影響。與ADMA處理組相比較,中濃度辛伐他汀+ADMA組細(xì)胞遷移比顯著下降(0.94±0.086vs1.30±0.30,P=0.011)。 (2)與DMSO組相比,低、中、高濃度的辛伐他汀對DDAH1轉(zhuǎn)錄本1(DDAH1-V1)mRNA表達均無顯著影響；中、高濃度的辛伐他汀呈濃度依賴性地下調(diào)DDAHI轉(zhuǎn)本2(DDAHI-V2)mRNA表達(0.52±0.24vs0.89±0.23,P=0.044和0.38±0.19vs0.89±0.23,P=0.0093)和轉(zhuǎn)錄本3(DDAH1-V3)的mRNA表達(0.59±0.19vs0.86±0.05,P=0.028和0.40±0.15vs0.86±0.05,P=0.0013)。 (3)與DMSO相比,低、中、高三個濃度的辛伐他汀處理12h呈濃度依賴性地上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)DDAH1-V1蛋白表達(低濃度：1.35±0.16vs1±0.00,P=0.03；中濃度：1.90±0.29vs1±0.00,P=0.00014；高濃度：1.95±0.04vs1±0.00,P=0.0001)。低、中濃度辛伐他汀有上調(diào)DDAH1蛋白表達的趨勢,但未達到顯著地統(tǒng)計學(xué)意義；高濃度辛伐他汀處理24h可顯著上調(diào)DDAHl-V1蛋白表達(2.11±0.55vs1±0.00,P=0.0097)。 (4)與DMSO組相應(yīng)時間點相比較,2.5μg/ml ActD在1-12h內(nèi)具有升高DDAHI-V1mRNA△CT(CTDDAH1轉(zhuǎn)錄本-CTGAPDH)的趨勢,且在處理后1h時達到統(tǒng)計學(xué)差異(5.63±0.64vs4.64±0.37,P=0.011)。與ActD相應(yīng)時間點相比,1μM Sim+ActD處理組1-4hDDlAH1-V1mRNA△CT值出現(xiàn)降低的趨勢,但僅1h和2h出現(xiàn)顯著下降(1h:4.66±0.27vs5.63±O.64,P=0.0085:2h:3.53±O.60vs5.89±0.15,P=0.021)；2μM Sim+ActD處理組1-8h DDAH1-V1mRNA△CT值有下降的趨勢,僅1h時具有顯著的差異(4.36±0.17vs5.63±0.64,P=0.0040)。 (5)與DMSO相比,ActD在8-12h有升高DDAH1-V2mRNA△CT的趨勢,且在8h達到顯著地統(tǒng)計學(xué)差異(8.06±0.49vs7.21±0.15,p=0.012)；與ActD2.5μg/ml相比,Sim1μM+ActD和Sim2μM+ActD處理對DDAH1-V2mRNA的△CT值無顯著影響。 (6)與DMSO相比,2.5μg/ml ActD處理2-12h DD4H1-V3mRNA的△CT有升高的趨勢,但無顯著地統(tǒng)計學(xué)差異。與ActD2.5μg/ml處理組相比,Sim1μM+ActD處理和Sim2μM+ActD處理對DDAH1-V3mRNA的△CT無顯著影響。 結(jié)論： (1)病理生理濃度的ADMA可促進原代培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞遷移,該作用可被辛伐他汀所逆轉(zhuǎn)。 (2)原代培養(yǎng)的HUVECs在辛伐他汀作用下,DDAH1-V2和DDAH1-V3mRNA表達顯著下降,而DDAH1-V1mRNA的表達相對穩(wěn)定,DDAH1-V1蛋白表達上調(diào)。 (3)辛伐他汀上調(diào)DDAH1-V1蛋白表達的機制可能與增加DDAH1-v1mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)。
【圖文】：

移的作用不顯著，與3 ADMA組相比較，ADMASim組細(xì)胞遷移數(shù)顯著下降（尸=0.002)(見表8，，圖1和圖2)。表8. ADMA對原代人濟靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響及辛伐他;丁的逆轉(zhuǎn)作用（* iSD )Groups Relative cell migration rateDMSO (Control) 1±0.003^M ADMA 1.30 士 0.30*3 nM ADMA + 1 Sim 0.94±0.086#*l^M Sim 0.80±0.22注：DMSO: 0.02% DMSO;. ADMA3nM ; 3nMADMA 處理組；Sim l|iM: l|alVI 辛伐他、；丁處理組；Sim luM +3nMADMA: l(xM 辛伐他丁和 3nM ADMA 共同處理；*P<0.05，與 DMSO處理相比較；*V<0.01，與3nM ADMA組相對比；每組n=8。

A處理對原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響及辛伐他；丁的作用。注：DMSMA 3uM: 3nM 的 ADMA+0.02% DMSO; Sim luM: 1 |uMI 辛伐他；丁ADMA3uM: 辛伐他打處理組和3nM的ADMA共同處理；*P<0.0較；Sim luM+ADMA3uM 與 ADMA3nM 對比，#*P<0.01;每組 n=8。他對原代人驕靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同轉(zhuǎn)錄本mRN的影響濃度辛伐他汀處理12h對細(xì)胞內(nèi)DDAW三個轉(zhuǎn)錄本的mRNA考文獻中辛伐他汀的處理濃度進行辛伐他汀濃度的確定，應(yīng)用、和2WVI)辛伐他汀（Sim)處理第3代原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)，與空白對照組相比較，DMSO溶劑對照組DZX4///三個轉(zhuǎn)錄本
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【共引文獻】

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本文編號：2555255