【摘要】：研究目的： 1.基于“上調(diào)MDRl基因、誘導(dǎo)P-gp外向轉(zhuǎn)運(yùn)解除中樞抑制藥物中毒”的機(jī)制研究,采用ATP酶活性測(cè)試法,考察待測(cè)藥物對(duì)P-gpATP酶活性的影響,明確藥物是否為P-gp底物,初步建立臨床中毒多發(fā)的中樞抑制藥物P-gp底物譜,從而明確適合該中毒解救治療方案的藥物。 2.采用藥物跨膜雙向轉(zhuǎn)運(yùn)法,考察待測(cè)中樞抑制藥物在血腦屏障上的轉(zhuǎn)運(yùn)特性,并進(jìn)一步確證P-gp是否參與這些藥物在血腦屏障上的轉(zhuǎn)運(yùn)。 3.考察在常規(guī)劑量與中毒劑量下,藥物本身對(duì)大鼠肝臟、前額葉皮質(zhì)與海馬中PXR信號(hào)通路調(diào)控I相代謝酶CYP3A4和Ⅲ相轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp的影響,并考察藥物過(guò)量中毒情況下給予PXR激活劑對(duì)大鼠肝臟、前額葉皮質(zhì)與海馬中PXR、CYP3A4與P-gp的mRNA與蛋白表達(dá)水平的影響,從而揭示通過(guò)激活PXR信號(hào)通路調(diào)控藥物代謝酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體協(xié)同促進(jìn)藥物消除的分子機(jī)制,以期為開(kāi)辟新的藥物中毒救治途徑奠定基礎(chǔ),為研究新型解毒藥物提供新的思路。 研究方法： 1.經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研,很多中樞抑制藥物均為P-gp的底物或調(diào)節(jié)子。以建立中樞抑制藥物P-gp底物譜為目標(biāo),制定研究藥物的入選標(biāo)準(zhǔn)并納入待研究藥物。建立ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線后,以P-gp ATP酶抑制劑四氧嘧啶作為陰性對(duì)照,以P-gpATPase誘導(dǎo)劑維拉帕米作為陽(yáng)性對(duì)照,用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)高、中、低濃度的待測(cè)化合物的熒光強(qiáng)度,經(jīng)數(shù)據(jù)處理后得到△RLUbasal與△RLUTc值并比較二者的大小,考察待測(cè)藥物對(duì)P-gpATPase活性的影響。 2.采用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與人星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方式建立人血腦屏障體外模型,并對(duì)模型特征進(jìn)行評(píng)價(jià),通過(guò)MTT法確定各藥物對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒濃度范圍,建立并驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)液中各待測(cè)藥物的定量分析方法,以P-gp熒光性探針底物Rh-123作為陽(yáng)性對(duì)照,采用雙向轉(zhuǎn)運(yùn)法考察入選的中樞抑制藥物跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)特性,并考察P-gp抑制劑對(duì)藥物跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,進(jìn)一步確證P-gp是否參與這些藥物在血腦屏障上的轉(zhuǎn)運(yùn)。 3.選擇喹硫平為中毒的模型藥物,選擇SD大鼠為中毒模型動(dòng)物,選擇地塞米松為核受體PXR的誘導(dǎo)劑。SD大鼠隨機(jī)分為4組,即空白組(Control組),喹硫平常規(guī)劑量組(Normal組),喹硫平中毒未干預(yù)組(Toxic組),以及喹硫平中毒地塞米松干預(yù)組(Toxic+Dex組),按分組進(jìn)行不同處理后,于預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)采集大鼠的肝臟、前額葉皮質(zhì)與海馬,利用Real-time PCR與Western-blot分子生物學(xué)技術(shù),考察不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的肝臟、前額葉皮質(zhì)與海馬中核受體PXR、Ⅰ相代謝酶CYP3A4、Ⅲ相轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp的mRNA與蛋白表達(dá)水平,并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 研究結(jié)果： 1.舒必利、齊拉西酮、西酞普蘭組的RLU值均大于維拉帕米組,推測(cè)這3個(gè)藥物對(duì)P-gp的親和力比維拉帕米弱。舒必利、齊拉西酮、西酞普蘭其ARLUTc均小于ARLUbasal,推測(cè)其可能為ATP酶抑制劑,可能會(huì)通過(guò)抑制ATP酶活性而抑制P-gp；高、中、低濃度的舒必利、齊拉西酮、西酞普蘭的RLU值無(wú)明顯差異,推測(cè)其對(duì)P-gp的抑制作用無(wú)濃度依賴性。高濃度的佐匹克隆與嗎氯貝胺其RLU值小于維拉帕米組,由此推測(cè)其在反應(yīng)過(guò)程中消耗ATP較多,故與P-gp的親和力較強(qiáng)；不同濃度的氯米帕明、中、低濃度的佐匹克隆與嗎氯貝胺的RLU值大于維拉帕米組,對(duì)P-gp的親和力比維拉帕米弱。佐匹克隆、氯米帕明、嗎氯貝胺在高濃度時(shí)△RLUTc大于△RLUbasal,在中、低濃度時(shí)其△RLUTc小于△RLUbasal,由此推測(cè)這3個(gè)藥物在高濃度時(shí)對(duì)P-gp有誘導(dǎo)作用,在中、低濃度時(shí)可通過(guò)抑制ATP酶的活性從而抑制P-gp。 2.采用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與人神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)方式所建立的體外血腦屏障模型具有高致密、低通透、表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)體等特征,建立較為快速、靈敏、特異的藥物濃度測(cè)定方法用于跨膜雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,與陽(yáng)性對(duì)照Rh-123所得結(jié)果相似,低、中、高濃度的舒必利與西酞普蘭的Papp(A-B)Papp(B-A)且ER2,B→A方向的轉(zhuǎn)運(yùn)高于A→B方向的轉(zhuǎn)運(yùn),表現(xiàn)出極性轉(zhuǎn)運(yùn)特征,推測(cè)舒必利和西酞普蘭為血腦屏障上P-gp的底物。當(dāng)加入P-gp抑制劑后,低、中、高濃度的舒必利與西酞普蘭的Papp(A-B)值增大,Papp(B=A)值減小,所得ER值接近1,提示當(dāng)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到抑制時(shí),P-gp底物雙向轉(zhuǎn)運(yùn)失去極性轉(zhuǎn)運(yùn)特性,該結(jié)果進(jìn)一步證明P-gp介導(dǎo)舒必利和西酞普蘭在體外血腦屏障上的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)。研究還發(fā)現(xiàn),低、中、高濃度的嗎氯貝胺、佐匹克隆和氯米帕明Papp(A-B)值略高于Papp(B-A)值且ER1,提示嗎氯貝胺、佐匹克隆和氯米帕明不具有極性轉(zhuǎn)運(yùn)特征,不是P-gp的底物；當(dāng)加入P-gp抑制劑后,低、中、高濃度的嗎氯貝胺、佐匹克隆和氯米帕明的表觀滲透率(Papp)未發(fā)生顯著變化,所得ER值仍然小于1,該結(jié)果提示P-gp抑制劑維拉帕米對(duì)嗎氯貝胺、佐匹克隆和氯米帕明的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有影響,P-gp不參與其在體外血腦屏障上的轉(zhuǎn)運(yùn)。 3.腹腔注射給予大鼠常規(guī)劑量喹硫平后,大鼠的肝臟、前額葉皮質(zhì)與海馬中核受體PXR、藥物代謝酶CYP3A4和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp的基因與蛋白表達(dá)水平高于空白組；腹腔注射給予大鼠常規(guī)劑量與中毒劑量喹硫平后,QTP中毒未干預(yù)組(Toxic組)的大鼠肝臟、前額葉皮質(zhì)與海馬中PXR、CYP3A4、P-gp的表達(dá)水平高于QTP常規(guī)劑量組(Normal組)；腹腔注射給予大鼠中毒劑量喹硫平后,QTP中毒DEX干預(yù)組(Toxic+Dex組)大鼠肝臟、前額葉皮質(zhì)與海馬中PXR、CYP3A4、P-gp的表達(dá)水平高于QTP中毒未干預(yù)組(Toxic組)。Toxic+Dex組大鼠體內(nèi)PXR-藥物代謝酶CYP3A4/轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp信號(hào)通路上調(diào)更快。 結(jié)論： 1.舒必利、齊拉西酮、佐匹克隆、氯米帕明、西酞普蘭及嗎氯貝胺均為P-gp底物(或抑制劑),其中,舒必利、齊拉西酮、西酞普蘭為非濃度依賴的ATP酶抑制劑,高、中、低濃度的各藥物對(duì)ATP酶的抑制作用無(wú)明顯差異；佐匹克隆、氯米帕明與嗎氯貝胺為濃度依賴的ATP酶雙向調(diào)節(jié)劑,在高濃度時(shí)可誘導(dǎo)ATP酶活性,對(duì)P-gp具有誘導(dǎo)作用,中、低濃度時(shí)可抑制ATP酶活性,對(duì)P-gp具有抑制作用。 2.雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,舒必利與西酞普蘭為P-gp的底物,P-gp介導(dǎo)其跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)；嗎氯貝胺、氯米帕明與佐匹克隆不是P-gp的底物,P-gp不參與其跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)合ATP酶活性測(cè)試所得結(jié)果,推測(cè)嗎氯貝胺、氯米帕明與佐匹克隆可能是P-gp抑制劑。將所得研究結(jié)果與文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果相結(jié)合,成功建立中樞抑制藥物P-gp底物(毒物)譜,明確了適合“上調(diào)MDRl誘導(dǎo)P-gp表達(dá)增加中樞抑制藥物外排”這一解救治療方案的藥物,為臨床藥物中毒的解毒治療提供了新的依據(jù)和手段。 3.喹硫平可自我誘導(dǎo)核受體PXR-藥物代謝酶CYP3A4/轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp這一信號(hào)通路,當(dāng)藥物過(guò)量時(shí)藥物的這種自我誘導(dǎo)效應(yīng)更為明顯,并且核受體PXR激動(dòng)劑可協(xié)同性地上調(diào)信號(hào)通路下游的藥物代謝酶CYP3A4與轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp的基因與蛋白表達(dá)水平。在藥物過(guò)量中毒時(shí),激活PXR可快速有效激活解毒系統(tǒng),從而可能達(dá)到快速清除體內(nèi)毒物以及保護(hù)機(jī)體免受毒物侵害的目的。本研究的實(shí)施有助于闡明藥物中毒時(shí)核受體PXR對(duì)代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控特征及分子機(jī)制,從而為開(kāi)辟新的藥物中毒救治途徑奠定基礎(chǔ),為研究新型解毒藥物提供新的思路。
【圖文】：

圖1-1 96孔板布局Figure 1-1 96-well plate layout：ATP標(biāo)準(zhǔn)：用于繪制ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線；NT:空白對(duì)照，與ATP酶活性無(wú)關(guān)；Na^V):無(wú)PgpATP酵，作為背景用于測(cè)定P-gp依賴的ATP酵:：舌性；Ver;維拉帕米為P-gp底物，可誘導(dǎo)P-gpATP醉活性及作為藥物誘導(dǎo)P-gpATP晦活性的陽(yáng)性對(duì)照;TC1-TC16:待測(cè)試化合物組。.4數(shù)據(jù)處理(1)計(jì)算四氧啼卩定組平均焚光值（RLUNa3V04)與空白組平均焚光值（RLUnt)差值，得到ARLUbasal，如公式（1)，ARLUbasal可反映基礎(chǔ)P-gpATP酶活性。RLUNa3vo4 - RLUnt = ARLUbasai (1)(2)計(jì)算四氧啼卩定組平均突光值（RLUNa3V04)與測(cè)試化合物組平均焚光值(RLUtc)的差值，得到ARLUTC，，如公式（2)，ARLUTC可反映存在測(cè)試化合物的況下糖蛋白ATP酶的活件。RLUNa3vo4 - RLUTC = ARLUTC (2)(3 )通過(guò)比較ARLUtc與ARLUbasai的大小，可確定各測(cè)試化合物對(duì)ATP酶活

and their comparison with basal value ( 2 )研究結(jié)果如圖1-5所示，通過(guò)對(duì)待測(cè)藥物與維拉帕米的RLU值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)高濃度的佐匹克隆與氯米帕明其RLU值小于維拉帕米組，由此推測(cè)其在反應(yīng)過(guò)程中消耗ATP較多，故與P-gp的親和力較強(qiáng)；而不同濃度的氯米帕明，中、低濃度的佐匹克隆與嗎氯貝胺組的RLU值大于維拉帕米組，對(duì)P-gp的親和力比維拉帕米弱。佐匹克隆、氯米帕明、嗎氯貝胺在高濃度時(shí)ARLUtC大于ARLUbasal，在中、低濃度時(shí)其ARLUtc小于ARLUbasal,由此推測(cè)這3個(gè)藥物在高濃度時(shí)對(duì)P-gp有誘導(dǎo)作用
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊慧文;劉海燕;李楊;劉曉東;謝林;楊志宏;;體外模型研究P-糖蛋白介導(dǎo)的拉莫三嗪在血腦屏障上的轉(zhuǎn)運(yùn)[J];中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年03期

本文編號(hào)：2546114