發(fā)布時間：2019-09-29 16:40

【摘要】：目的：腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過其復(fù)雜精細(xì)的星形結(jié)構(gòu)與神經(jīng)元密切接觸,對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能有著重要的作用。而傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)方法使星形膠質(zhì)細(xì)胞失去了它典型的多突起星形形態(tài)而呈現(xiàn)出扁平少突起的形態(tài),所以構(gòu)筑一個與體內(nèi)相似的生長環(huán)境,是進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞體外形態(tài)功能研究的基礎(chǔ)。本實驗采用具有不同分形維數(shù)和疏水程度的三棕櫚酸甘油酯表面來模擬腦內(nèi)的分形環(huán)境,研究其對原代星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能的影響。方法：本實驗采用具有良好生物兼容性的三棕櫚酸甘油酯(PPP)合成三組具有不同疏水角度的表面(分別是105°～115°、125°～135°、150°～160°),將原代培養(yǎng)的新生SD大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到多聚賴氨酸(PLL)包被表面以及三組不同疏水角的PPP表面,培養(yǎng)1、2、3天。(1)通過MTT細(xì)胞活力測定、Hoechst/PI細(xì)胞凋亡染色、特征骨架蛋白GFAP、F-actin的免疫組化染色以及掃描電鏡考察不同表面對星形膠質(zhì)細(xì)胞生長和形態(tài)的影響。 (2)將出生后1天、4天、7天、14天的SD大鼠大腦皮層作為體內(nèi)對照,通過特征蛋白Nestin、Vimentin、GFAP、GS的免疫印跡分析,考察150°～160°超斥水分形表面培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞是否具有更接近體內(nèi)細(xì)胞的生物特征。(3)將150°～160°超斥水分形表面上培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞對與SD大鼠皮層神經(jīng)元共培養(yǎng),通過神經(jīng)元標(biāo)記蛋白β-tubulinⅢ、DCX、 NeuN的免疫化學(xué)染色,考察星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元生長與分化的影響。同時測定星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的NGF含量,并運用NGF中和性抗體拮抗培養(yǎng)基中的NGF,初步探討分形材料表面培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞影響神經(jīng)元生長分化的機(jī)制。結(jié)果： (1)與PLL包被表面上培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞相比,斥水分形PPP表面上培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量顯著減少,凋亡與壞死程度顯著降低,并且呈現(xiàn)出一種更為立體的多突觸星形狀。隨著時間以及疏水角度的增加,細(xì)胞的分形維數(shù)、初級突觸的數(shù)量、突觸上分支的數(shù)量、以及突觸占整個細(xì)胞的比例也隨之增加,其中1500～1600的超疏水PPP表面對細(xì)胞的影響更為顯著,類似由三維材料Alvetex(?)Scaffold培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。(2)150°～160°超疏水PPP材料上培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在Nestin、Vimentin、GFAP、GS四種特征蛋白的表達(dá)上與傳統(tǒng)培養(yǎng)相比更接近于大鼠體內(nèi)的表達(dá)趨勢。(3)150°～160°超疏水PPP材料上培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過分泌更多的神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF,促進(jìn)與其共培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元的增殖與分化。結(jié)論：三棕櫚酸甘油酯疏水分形表面可以使原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生與體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞相似的復(fù)雜形態(tài)及生物特征,也許能為星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外研究提供更為良好的條件,為了解星形膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)的功能特征提供了有利途徑,并對細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)也有重要意義。
【圖文】：

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文邐實驗結(jié)果逡逑ＭＴＴ還原值（圖２．Ａ）和單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量（圖２．Ｂ）上都顯著低于ＰＬＬ組，逡逑不同疏水角度的ＰＰＰ表面之間無顯著差異。從細(xì)胞調(diào)亡（圖２．Ｃ）和細(xì)胞壞死（圖逡逑２．Ｄ）兩項指標(biāo)上可以看出，ＰＰＰ表面培養(yǎng)的細(xì)胞的死亡情況要顯著低于ＰＬＬ組，逡逑說明ＰＰＰ培養(yǎng)表面細(xì)胞數(shù)量的減少與細(xì)胞死亡無關(guān)。同時，根據(jù)ｔｗｏ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ逡逑檢驗結(jié)果，在１５０°？１６０°超疏水表面培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡率要顯著低于其他疏逡逑水角度的ＰＰＰ表面（；３＜０．０１）。由于普通材料表面是由ＰＬＬ包被的，為排除ＰＬＬ逡逑對結(jié)果的影響，我們同樣在１５０°￣１６０°超疏水表面包被多賴（ＰＬＬ－ＰＰＰ），考察細(xì)逡逑胞在這種表面的細(xì)胞數(shù)量以及調(diào)亡壞死率。從圖１中可以看出，ＰＬＬ－ＰＰＰ表面培逡逑養(yǎng)的細(xì)胞在各個指標(biāo)都與１５０°？１６０°超疏水表面上的細(xì)胞無顯著差異。由此可以判逡逑斷

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文邐實驗結(jié)果逡逑ＭＴＴ還原值（圖２．Ａ）和單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量（圖２．Ｂ）上都顯著低于ＰＬＬ組，逡逑不同疏水角度的ＰＰＰ表面之間無顯著差異。從細(xì)胞調(diào)亡（圖２．Ｃ）和細(xì)胞壞死（圖逡逑２．Ｄ）兩項指標(biāo)上可以看出，，ＰＰＰ表面培養(yǎng)的細(xì)胞的死亡情況要顯著低于ＰＬＬ組，逡逑說明ＰＰＰ培養(yǎng)表面細(xì)胞數(shù)量的減少與細(xì)胞死亡無關(guān)。同時，根據(jù)ｔｗｏ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ逡逑檢驗結(jié)果，在１５０°？１６０°超疏水表面培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡率要顯著低于其他疏逡逑水角度的ＰＰＰ表面（；３＜０．０１）。由于普通材料表面是由ＰＬＬ包被的，為排除ＰＬＬ逡逑對結(jié)果的影響，我們同樣在１５０°￣１６０°超疏水表面包被多賴（ＰＬＬ－ＰＰＰ），考察細(xì)逡逑胞在這種表面的細(xì)胞數(shù)量以及調(diào)亡壞死率。從圖１中可以看出，ＰＬＬ－ＰＰＰ表面培逡逑養(yǎng)的細(xì)胞在各個指標(biāo)都與１５０°？１６０°超疏水表面上的細(xì)胞無顯著差異。由此可以判逡逑斷
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965


本文編號：2544037