【摘要】：化療耐藥已成為乳腺癌治療中一種嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。有研究表明,細(xì)胞間能通過(guò)多種途徑進(jìn)行信息交流,包括通過(guò)外泌體將耐藥性狀傳遞給受體細(xì)胞的途徑。在本課題中,我們著重分析攜帶有UCH-L1蛋白的外泌體在耐藥傳遞中的作用,以及其潛在的臨床診斷價(jià)值。我們選用人敏感型乳腺癌細(xì)胞MCF7/WT細(xì)胞和人耐阿霉素型乳腺癌細(xì)胞MCF7/ADM進(jìn)行探究化療耐藥的機(jī)制。通過(guò)使用CellTiter-Blue(CTB)細(xì)胞活力分析顯示,MCF7/ADM細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥指數(shù)是MCF7/WT細(xì)胞的40多倍。通過(guò)檢測(cè)帶有自發(fā)紅色熒光的阿霉素,從而檢測(cè)化療藥物在腫瘤細(xì)胞中的分布情況。在MCF7/WT細(xì)胞中,阿霉素主要聚集在細(xì)胞核處,發(fā)揮其干擾DNA合成代謝的作用,而在MCF7/ADM細(xì)胞中,阿霉素大部分聚集在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中,在細(xì)胞核中只有少量的聚集,從而降低了阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。我們使用蛋白免疫印跡法(Western blot)證明了泛素羧基末端水解酶L1(Ubiquitin carboxyl terminal hydrolase-L1,UCH-L1)、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular-signal regulated protein kinase,ERK1/2)以及磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Phospho-extracellular-signal regulated protein kinase,p-ERK1/2)在MCF7/WT細(xì)胞、MCF7/ADM細(xì)胞的表達(dá)情況,并檢測(cè)通過(guò)siRNA下調(diào)UCH-L1-silencing MCF7/ADM細(xì)胞中UCH-L1表達(dá),對(duì)其UCH-L1、P-gp表達(dá)情況以及ERK1/2磷酸化的影響。結(jié)果顯示,MCF7/ADM細(xì)胞中UCH-L1蛋白、P-gp蛋白表達(dá)以及ERK1/2磷酸化的程度顯著高于MCF7/WT細(xì)胞和UCH-L1-silencing MCF7/ADM細(xì)胞。結(jié)果展示了MCF7/ADM細(xì)胞中UCH-L1蛋白可以通過(guò)激活MAPK/ERK信號(hào)通路提高P-gp中的高表達(dá)。在探討經(jīng)外泌體傳遞途徑的耐藥性狀改變時(shí),借助細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀分析和免疫熒光檢測(cè)證實(shí),MCF7/ADM細(xì)胞能分泌攜帶有UCH-L1蛋白和P-gp蛋白的外泌體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞微環(huán)境,能被MCF7/WT細(xì)胞以時(shí)間依賴性方式所吸收,并且能傳遞耐藥細(xì)胞的耐藥性狀。將MCF7/WT細(xì)胞與耐藥細(xì)胞來(lái)源的外泌體共培養(yǎng)后,我們通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn),MCF7/WT細(xì)胞的耐藥性提高7倍以上。為了驗(yàn)證UCH-L1蛋白在外泌體耐藥傳遞過(guò)程中的作用,我們通過(guò)使用UCH-L1特異性抑制劑LDN-57444來(lái)阻斷其蛋白活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LDN-57444預(yù)處理過(guò)的MCF7/ADM細(xì)胞來(lái)源外泌體與MCF7/WT細(xì)胞共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)后者的耐藥性較之前沒(méi)有顯著性的升高。在之前的研究中,UCH-L1蛋白在MCF7/ADM細(xì)胞中,可通過(guò)激活MAPK/ERK信號(hào)通路提高P-gp蛋白的表達(dá),我們進(jìn)一步分析這種機(jī)制是否存在于通過(guò)外泌體的耐藥性狀傳遞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MCF7/WT細(xì)胞在與MCF7/ADM細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)后,其UCH-L1和P-gp蛋白表達(dá)水平提高,同時(shí)ERK1/2磷酸化的水平升高。以上結(jié)果提示,攜帶有UCH-L1蛋白的外泌體,不僅攜帶UCH-L1蛋白進(jìn)入受體細(xì)胞,還激活MAPK/ERK信號(hào)通路提高P-gp蛋白的表達(dá),提高受體細(xì)胞對(duì)阿霉素的抵抗能力。我們收集93例臨床乳腺癌患者血漿樣本和腫瘤樣本,通過(guò)免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),瘤體上UCH-L1蛋白的表達(dá)和循環(huán)血中外泌體的UCH-L1蛋白表達(dá)具有一致性。值得注意的,在化療前血漿樣本中,外泌體攜帶的UCH-L1蛋白水平和化療療效呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)。提示其可作為化療前預(yù)測(cè)化療療效的一種標(biāo)志物。我們的研究證明了攜帶有UCH-L1的外泌體可以傳遞耐藥性狀給受體細(xì)胞,并且可以作為晚期患者非侵入性化療耐藥診斷指標(biāo),協(xié)助臨床實(shí)現(xiàn)更有效的個(gè)體化治療的實(shí)施。
【圖文】：

B 細(xì)胞活力檢測(cè) MCF7/WT 細(xì)胞和 MCF7/ADM 細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性（***P<0CTB assays showing MCF7/ADM had greater resistance toAdriamycin than the pareMCF7/WT.***P<0.001 compared with MCF7/WT cells.分布實(shí)驗(yàn)霉素來(lái)檢測(cè)化療藥物的亞細(xì)胞分布因具有發(fā)紅色熒光的特性[77]。使用微鏡，可對(duì)阿霉素在兩株乳腺癌細(xì)胞的分布有直觀的認(rèn)識(shí)。結(jié)果如圖素作用 12h 后，在 MCF7/WT 細(xì)胞中阿霉素匯聚在細(xì)胞核中發(fā)揮其藥理示阿霉素紅色熒光與核染料 DAPI 的藍(lán)色熒光重合；相比之下，MCF霉素分布在細(xì)胞膜表面，被排出其發(fā)揮藥理作用的細(xì)胞核內(nèi)。

活力檢測(cè) MCF7/WT 細(xì)胞和 MCF7/ADM 細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性（** assays showing MCF7/ADM had greater resistance toAdriamycin than theMCF7/WT.***P<0.001 compared with MCF7/WT cells.布實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)化療藥物的亞細(xì)胞分布因具有發(fā)紅色熒光的特性[77]。，，可對(duì)阿霉素在兩株乳腺癌細(xì)胞的分布有直觀的認(rèn)識(shí)。結(jié)果用 12h 后，在 MCF7/WT 細(xì)胞中阿霉素匯聚在細(xì)胞核中發(fā)揮其霉素紅色熒光與核染料 DAPI 的藍(lán)色熒光重合；相比之下，分布在細(xì)胞膜表面，被排出其發(fā)揮藥理作用的細(xì)胞核內(nèi)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2528830