【摘要】：背景:近年來,全基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展使人類能夠在分子水平上對微生物有一個更加深入的認(rèn)識。研究發(fā)現(xiàn),許多次級代謝產(chǎn)物生物合成基因大都聚集排列成簇存在,這些基因簇的轉(zhuǎn)錄表達(dá)不僅受到全局性調(diào)控蛋白的影響,還與途徑特異性調(diào)控因子和染色質(zhì)介導(dǎo)的調(diào)控有關(guān)。染色質(zhì)介導(dǎo)的調(diào)控通過表觀遺傳對組蛋白進(jìn)行修飾如甲基化、組蛋白乙�；�、磷酸化、泛素化等改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象,促進(jìn)或抑制一些DNA與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,來實現(xiàn)激活或沉默一些基因簇的表達(dá)。近年來,以組蛋白去乙�；笧榘悬c進(jìn)行微生物育種越來越受到研究者的歡迎,對組蛋白去乙�；富蜻M(jìn)行分子遺傳操作或通過化學(xué)小分子抑制劑作用于去乙�；�,來改變組蛋白乙�；腿ヒ阴；瘎討B(tài)平衡,這樣不僅可以讓真菌次生代謝行為發(fā)生明顯變化,提高多種已知代謝產(chǎn)物生物合成基因表達(dá),還能激活沉默基因簇,產(chǎn)生新的化合物。絲狀真菌橘青霉(Penicillium citrinum)作為一種重要的藥用微生物,其代謝產(chǎn)物美伐他汀和橘霉素在人們生活中發(fā)揮著重要作用。美伐他汀是降血脂藥物普伐他汀的前體,具有較好的藥用開發(fā)價值。本實驗室對橘青霉全基因組進(jìn)行了測序并初步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):橘青霉基因組中存在54個次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇,其中聚酮類化合物(PKS)14個,非核糖體多肽類(NRPS)17個,萜類(Terpenes)8個,其它類11個,目前報道的只有美伐他汀生物合成基因簇。組蛋白去乙�；感蛄衧cRpd3、scHda1以及sc Sir2是當(dāng)前人們對去乙�；阜诸惖闹饕獏⒖夹蛄�,均來自于釀酒酵母,通過本地blast分析,我們發(fā)現(xiàn)橘青霉中與之同源的蛋白序列分別是Pci-Rpd3為57.9%、Pci-Hda1為54.9%以及Pci-Sir2為50%。這些組蛋白去乙�；甘欠駞⑴c橘青霉次級代謝和生長發(fā)育具有重要研究意義。目的:結(jié)合化學(xué)小分子抑制劑丁酸鈉(SB)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)和分子遺傳學(xué)手段對橘青霉組蛋白進(jìn)行表觀遺傳修飾,靶向改變表觀遺傳酶類的表達(dá),探究組蛋白去乙�；富騬pd3對橘青霉美伐他汀產(chǎn)量生物合成和生長發(fā)育的影響,為研究絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物的表觀遺傳調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。方法:1.采用96孔板稀釋法檢測小分子抑制劑SB和SAHA的最低抑菌濃度,然后設(shè)置濃度梯度在PGA培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),第八天后對發(fā)酵液進(jìn)行處理,通過HPLC進(jìn)行檢測,觀察美伐他汀產(chǎn)量的變化。2.選擇化學(xué)小分子抑制劑的一個最適濃度,檢測在小分子抑制劑作用下橘青霉菌落形態(tài)、菌絲發(fā)育及菌體干重的變化,通過RT-q PCR檢測橘青霉無性生殖相關(guān)基因aba A和brl A和美伐他汀生物合成相關(guān)基因mlc B和mlc R轉(zhuǎn)錄水平的變化。3.對橘青霉全基因組測序,通過本地blast、NCBI等軟件分析橘青霉組蛋白去乙�；�,采用RT-qPCR檢測并比較小分子抑制劑作用下橘青霉組蛋白去乙�；富蜣D(zhuǎn)錄水平的差異。4.克隆組蛋白去乙�；富騬pd3全長,通過酶切、純化和連接等分子操作構(gòu)建pGiHTGi-rpd3重組載體。然后將重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium)LBA4404中,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建OE::rpd3菌株,并經(jīng)抗性平板和PCR進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子篩選。5.在PGA培養(yǎng)基中對橘青霉野生型和OE::rpd3菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),第8天后對發(fā)酵液萃取處理進(jìn)行HPLC檢測,觀察美伐他汀產(chǎn)量的變化;與野生型對比觀察菌落形態(tài)、菌絲生長、孢子產(chǎn)量的變化。利用RT-qPCR檢測橘青霉無性生殖和美伐他汀生物合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平,從而探究組蛋白去乙�；富騬pd3對橘青霉次級代謝產(chǎn)物和生長發(fā)育的影響。結(jié)果:1.通過96孔板稀釋法測得SB作用下橘青霉MIC值為50 mM,當(dāng)SB濃度≤0.05 m M,美伐他汀的產(chǎn)量與空白組相比無明顯變化;當(dāng)SB濃度≥25 m M時,美伐他汀的產(chǎn)量急劇下降;其中在1 mM SB作用下,美伐他汀產(chǎn)量最大為61.485±1.735 mg/L,空白組產(chǎn)量為55.437±1.233 mg/L,較空白組增加了10.91%。2.SAHA作用下橘青霉MIC值為250μM,當(dāng)SAHA濃度㩳0.005μM時,美伐他汀的產(chǎn)量趨于平穩(wěn),與空白組無明顯差別;當(dāng)SAHA濃度㧐1.00μM時,美伐他汀產(chǎn)量迅速下降;當(dāng)SAHA濃度為0.01μM時,美伐他汀產(chǎn)量達(dá)到最大60.692±1.579 mg/L,空白組產(chǎn)量為51.496±1.07 mg/L,較空白組增加了19.74%。3.RT-qPCR檢測,與空白組相比,在1 mM SB作用下,美伐他汀生物合成相關(guān)基因mlc R,mlc B的相對表達(dá)量上調(diào)約為190%和140%;與無性生殖相關(guān)的基因aba A,brlA表達(dá)量上調(diào)約為127%和101%;當(dāng)SAHA濃度為0.01μM時,美伐他汀生物合成相關(guān)基因mlc R,mlc B的表達(dá)量是對照組的3.61倍和4.09倍;無性生殖相關(guān)基因aba A,brlA的表達(dá)量約為對照組的1.66倍和2.25倍。1 mM SB和0.01μM SAHA作用橘青霉,組蛋白去乙�；富騬pd3、hda1轉(zhuǎn)錄水平受到抑制且對rpd3的轉(zhuǎn)錄抑制效果較為明顯,其相對表達(dá)量分別為0.732±0.089和0.231±0.004,與空白組相比明顯下調(diào)了,但sir2的轉(zhuǎn)錄水平則變化不大。4.成功構(gòu)建pGiHTGi-rpd3重組載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入橘青霉并篩選得到rpd3過表達(dá)菌株OE::rpd3。5.通過在PGA培養(yǎng)基中發(fā)酵,與野生型對比rpd3過表達(dá)株美伐他汀產(chǎn)量大幅下降,約為野生型的1/2;生長發(fā)育與野生型對比,OE::rpd3菌株生長發(fā)育明顯滯后;RT-q PCR檢測后,與野生型相比,OE::rpd3菌株美伐他汀生物合成途徑轉(zhuǎn)錄因子mlcR在48 h和72 h的相對表達(dá)量分別下調(diào)10.33%和65.46%;美伐他汀生物合成基因mlc B在36 h、48 h和72 h的相對表達(dá)量分別下調(diào)65.75%、48.16%和49.31%。無性生殖相關(guān)基因abaA在36 h、48 h和72 h的相對表達(dá)量分別下調(diào)54.91%、94.75%和23.48%;brl A在36 h、48 h和72 h的相對表達(dá)量分別下調(diào)88.93%、74.54%和5.92%。橘青霉OE::rpd3菌株全局性調(diào)控因子Lae A的轉(zhuǎn)錄也受到一定的抑制作用,在48 h和72 h的相對表達(dá)量約為野生型的1/2和1/3。結(jié)論:化學(xué)小分子抑制劑在一定的濃度范圍內(nèi)能夠影響橘青霉主要次級代謝產(chǎn)物美伐他汀的生物合成和無性生殖,并表現(xiàn)出促進(jìn)的作用。在1 mM SB作用下,美伐他汀產(chǎn)量較野生型增加10.91%;當(dāng)SAHA濃度為0.01μM時,美伐他汀產(chǎn)量提高了19.74%。將橘青霉組蛋白去乙�；富騬pd3過表達(dá)后,美伐他汀產(chǎn)量大幅下降,產(chǎn)量約為野生型的1/2,其生長發(fā)育出現(xiàn)明顯的滯后。橘青霉組蛋白去乙�；富騬pd3對美伐他汀生物合成和生長發(fā)育起到一個負(fù)調(diào)控的作用,我們推測在橘青霉染色質(zhì)介導(dǎo)調(diào)控次級代謝產(chǎn)物及生長發(fā)育過程中,對組蛋白進(jìn)行去乙�；揎�,導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化,一些全局性調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平受到一定程度的激活或抑制如全局性調(diào)控因子Lae A,直接或間接影響機(jī)體代謝和生長發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R914;R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2523259