【摘要】：第一部分無(wú)煙氣煙草水提取物對(duì)線粒體損傷作用的研究 目的：研究無(wú)煙氣煙草水提取物（Smokeless tobacco water extract，STWE）對(duì)線粒體的損傷作用。方法：選取人肝癌細(xì)胞株HepG2、人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5為工具細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到90%以上后，收集細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。（1）采用MTT法觀察不同濃度STWE對(duì)HepG2和MRC-5細(xì)胞的增殖影響，計(jì)算上述細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50。以STWE最大可配濃度10mg/ml為初始濃度，倍比稀釋為STWE不同作用濃度，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48h后，檢測(cè)490nm處吸光度值（OD值），計(jì)算IC50。（2）根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在HepG2和MRC-5細(xì)胞上，選取625.00μg/ml、312.50μg/ml、156.25μg/ml三個(gè)STWE作用濃度，，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，作用24h。透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。（3）選取625.00μg/ml、312.50μg/ml、156.25μg/ml三個(gè)STWE濃度，檢測(cè)STWE線粒體毒性。①線粒體膜電位檢測(cè)：JC 1試劑盒檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平。②細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)：GEMNED活性氧高質(zhì)熒光檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ROS水平。③線粒體DNA編碼基因檢測(cè)：提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞total RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-Time PCR法檢測(cè)線粒體DNA編碼12S rRNA、NDⅠ、COXⅡ基因表達(dá)水平。（4）細(xì)胞凋亡檢測(cè)：FITCAnnexin VApoptosis Detection Kit Ⅰ檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡水平。（5）細(xì)胞周期檢測(cè)：Real-Time PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因P53、CDK2和MDM2基因表達(dá)水平。結(jié)果：（1）MTT結(jié)果顯示，梯度濃度STWE作用48h后， HepG2、MRC-5細(xì)胞增殖率成劑量依賴(lài)性下降。HepG2、MRC-5兩種細(xì)胞的IC50值分別為447.00μg/ml和441.00μg/ml。據(jù)此選取IC50上下三個(gè)劑量625.00μg/ml、312.50μg/ml、156.25μg/ml為給藥劑量。（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)透射電鏡檢測(cè)結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，STWE各劑量組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞微絨毛減少或消失、空泡、水腫、細(xì)胞核及染色質(zhì)皺縮等改變，以625.00μg/mlSTWE組細(xì)胞損傷最明顯。（3）①線粒體膜電位流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，STWE能劑量依賴(lài)性地降低HepG2和MRC-5細(xì)胞線粒體膜電位。②細(xì)胞ROS流式結(jié)果顯示，STWE能劑量依賴(lài)性地增加HepG2和MRC-5細(xì)胞ROS水平。③線粒體DNA編碼基因檢測(cè)結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，STWE各劑量組均可上調(diào)HepG2細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞線粒體DNA編碼的12SrRNA、NDⅠ、COXⅡ基因mRNA表達(dá)水平。（4）細(xì)胞凋亡流式結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，STWE能劑量依賴(lài)性地升高細(xì)胞凋亡水平。（5）細(xì)胞周期檢測(cè)：與空白對(duì)照組相比，STWE各劑量組細(xì)胞的周期相關(guān)基因CDK2、MDM2mRNA水平表達(dá)在HepG2和MRC-5細(xì)胞內(nèi)都升高，而HepG2中未檢測(cè)到P53基因表達(dá)，MRC-5細(xì)胞P53表達(dá)降低。結(jié)論：STWE對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2、人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5線粒體都有不同程度的損傷作用，且劑量依賴(lài)性造成線粒體膜電位下降、細(xì)胞凋亡率增高、活性氧產(chǎn)生增多，并且有引起細(xì)胞惡變的趨勢(shì)。 第二部分NLRP3炎癥小體在無(wú)煙氣煙草水提取物致線粒體損傷中的作用 目的：研究不同濃度STWE作用下，人肝癌細(xì)胞株HepG2、人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5及小鼠肺組織內(nèi)NLRP3炎癥小體表達(dá)變化，探討NLRP3炎癥小體及其效應(yīng)因子在線粒體損傷中的作用。方法：（一）體外實(shí)驗(yàn)。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取312.50μg/ml和156.25μg/ml的STWE為給藥濃度。實(shí)驗(yàn)共五組，分別為：空白對(duì)照組、156.25μg/ml STWE組、單獨(dú)LPS刺激4h組、LPS預(yù)處理4h+156.25μg/mlSTWE組、LPS預(yù)處理4h+312.50μg/ml STWE組。（1）提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞total RNA，Real-Time PCR檢測(cè)NLRP3炎癥小體各組分基因NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá)變化。（2）提取各組細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測(cè)炎癥小體相關(guān)組分蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)變化。（3）收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，使用Human IL-1βImmunoassay Kit測(cè)定NLRP3炎癥小體激活后釋放的主要效應(yīng)因子IL-1β的濃度。（二）體內(nèi)試驗(yàn)。清潔級(jí)C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、5mg/kg STWE組、10mg/kg STWE組、20mg/kg STWE組，連續(xù)灌胃給藥15天。（1）給藥結(jié)束后，取小鼠肺臟組織做病理切片，觀察不同濃度組STWE對(duì)肺組織的損傷。（2）同時(shí)，取小鼠肺臟組織做免疫組化，檢測(cè)不同STWE劑量組小鼠肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18水平。結(jié)果：（一）體外實(shí)驗(yàn)。（1）RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，LPS預(yù)處理再聯(lián)合不同濃度STWE刺激組NLRP3、ASC和Caspase-1基因表達(dá)水平均顯著性升高（P0.05）。（2）Western Blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，LPS預(yù)處理再聯(lián)合兩個(gè)劑量STWE刺激組NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平均明顯升高。（3）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，LPS預(yù)處理再給予不同濃度STWE刺激組IL-1β蛋白分泌水平均顯著性升高（P0.05）。（二）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。（1）病理組織結(jié)果顯示，生理鹽水對(duì)照組和5mg/kgSTWE作用組肺組織基本正常，10mg/kg及20mg/kg STWE組肺組織則分別出現(xiàn)不同程度的巨噬細(xì)胞聚集和局灶性炎癥。（2）免疫組化結(jié)果顯示，生理鹽水對(duì)照組NLRP3、ASC和Caspase-1表達(dá)很低，隨著STWE作用濃度的升高，三者的表達(dá)呈上升的趨勢(shì)。IL-1β和IL-18在生理鹽水對(duì)照組和5mg/kg STWE組小鼠肺臟組織細(xì)胞中無(wú)表達(dá)或表達(dá)非常低，10mg/kg和20mg/kg STWE組表達(dá)有升高趨勢(shì)。結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)STWE能夠激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)NLRP3、Caspase-1、ASC等的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明高劑量的STWE同時(shí)能促進(jìn)炎癥因子IL-18和IL-1β的分泌和表達(dá)的趨勢(shì)。 第三部分NLRP3、ASC和Caspase-1三種基因敲除小鼠的飼養(yǎng)、繁殖與基因型鑒定 目的：飼養(yǎng)、繁殖及鑒定NLRP3基因敲除小鼠、ASC基因敲除小鼠和Caspase-1基因敲除小鼠，為本課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供模型動(dòng)物。方法：將引進(jìn)的NLRP3+/-小鼠、ASC+/-小鼠、Caspase-1+/-小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)及品系內(nèi)配種繁殖，提取子代小鼠的耳朵基因組DNA，用PCR方法和T7E1酶切法鑒定基因型，依照孟德?tīng)栠z傳定律可能得到野生型、雜合子及純合子三種基因型。結(jié)果：成功掌握了NLRP3、ASC和Caspase-1三種基因敲除小鼠的飼養(yǎng)及繁殖技術(shù)，并分別獲得了較多的上述三種基因敲除純合子小鼠。結(jié)論：正確的小鼠飼養(yǎng)、繁殖及鑒定方法，有助于快速獲得NLRP3、ASC、Caspase-1三種基因敲除純合子小鼠。
[Abstract]:Study on the effect of the first part of the non-flue-gas-free tobacco water extract on the mitochondrial injury Objective: To study the damage of the non-smoke-free tobacco water extract (STWE) to the mitochondria. The method comprises the following steps of: selecting human liver cancer cell line HepG2 and human embryonic lung fibroblast cell strain MRC-5 as a tool cell, (1) The effect of STWE on the proliferation of HepG2 and MRC-5 cells was observed by MTT method, and half of the inhibition concentration IC5 of the cells was calculated. 0. The absorbance value (OD value) at 490 nm was measured after incubation for 48 h in the blank control,37 鈩

本文編號(hào)：2492595