【摘要】：研究目的骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)的發(fā)病機理非常復(fù)雜,現(xiàn)在的研究表明補體系統(tǒng)在OA的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用,而補體系統(tǒng)的替代途徑在OA中又占據(jù)主要位置。硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)是由D-葡糖醛酸殘基和N-乙酰-D-半乳糖胺殘基組成的雙糖單位線性連接組成的一類糖胺聚糖,大量的研究表明其具有緩解、治療OA的生物學(xué)功能。其中低分子量硫酸軟骨素(1owmolecular weight chondroitin sulfate,LMWCS)在緩解、治療OA方面效果更加明顯。但是1MWCSs通過與補體系統(tǒng)相互作用起到防治OA的作用目前尚未有研究。同時LMWCSs由于來源不同、制備工藝不同等導(dǎo)致其具有不同的生物活性,探討LMWCS s與抗補體活性的構(gòu)效關(guān)系,闡明LMWCSs的結(jié)構(gòu)對補體活性的影響,將對LMWCSs防治OA奠定一定的理論基礎(chǔ),同時對LMWCSs的生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。為了探討CS抗補體作用與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系及抗補體作用在其防治OA中發(fā)揮的作用,本研究采用4種不同的降解方法對3種不同來源的CS進行降解得到一系歹LMWCSs,然后對這些LMWCSs的抗補體活性進行評價,研究LMWCSs結(jié)構(gòu)與抑制補體替代途徑活性之間的構(gòu)效關(guān)系,并選出一種抗補體活性較高的LMWCS。通過對活性較高的LMWCS的體內(nèi)、體外的活性評價,證明其抗補體活性與其防治OA的關(guān)系。最后,針對于目前篩選CS的抗補體活性的方法存在費時、費力的問題,通過利用近紅外光譜分析技術(shù)建立一種快速無損的高通量篩選CS抗補體活性的方法。研究方法1 LMWCSs的制備及表征本研究擬采用氧化降解法、酶解法、酸降解法以及微波輔助堿降解法對鯊魚來源、豬來源和牛來源的CS進行降解得到不同的LMWCSs。采用傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography,HPLC)、紫外可見光譜法、分子排阻色譜-多角度激光散射法(size exclusion chromatography-multi angle light scattering, SEC-MALLS)、核磁(ruclear magnetic resonance,NMR)等方法對LMWCSs的性質(zhì)進行表征和研究。2不同LMWCSs的抗補體活性研究與構(gòu)效關(guān)系分析采用溶血法測定LMWCSs抑制替代途徑活性的IC50值,通過利用性質(zhì)的表征結(jié)果對LMWCSs的結(jié)構(gòu)和LMWCSs的抗補體活性之間的構(gòu)效關(guān)系進行研究,分析其構(gòu)效關(guān)系,進而選擇出一種具有較好的抗補體活性的LMWCS用于進一步的體內(nèi)外活性研究。3LMWCS對軟骨細(xì)胞的影響體外研究采用酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的方法研究LMWCS對補體替代途徑激活過程中補體蛋白3(complement 3,C3)沉積的影響；采用補體介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞死亡的方法研究LMWCS通過抑制補體活性保護軟骨細(xì)胞的作用；采用RT-PCR的方法研究替代途徑激活的情況下,LMWCS對軟骨細(xì)胞C3 mRNA水平的影響。4 LMWCS對實驗性骨性關(guān)節(jié)炎的影響研究通過采用小鼠內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定(destabilization of the medial meniscus,DMM)的方法誘導(dǎo)建立OA模型�？疾霯MWCS通過口服給藥調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)緩解、治療OA的情況。利用測定小鼠后腿支撐力差值的方法考察小鼠OA的疼痛程度；利用番紅固綠染色對LMWCS緩解OA的程度進行分析；利用ELISA和免疫組化的方法分別檢測小鼠體內(nèi)C5b-9的含量水平以及小鼠關(guān)節(jié)軟骨的C5b-9的含量。5基于近紅外光譜分析技術(shù)的CS抗補體活性篩選方法的建立收集不同來源、不同相對分子質(zhì)量(Mr)的CS樣品。采用漫反射的方式采集近紅外光譜,利用溶血法測定樣品抑制替代途徑補體活性的IC50。通過利用因子實驗設(shè)計的方法優(yōu)選最佳預(yù)處理方法,利用無信息變量消除(uninformativevariable elimination, UVE),競爭自適應(yīng)加權(quán)采樣(competitive adaptive reweighted sampling,CARS)和隨機蛙跳(rondom frog)的方法選擇有效信息建立偏最小二乘(partial least square,PLS)回歸模型,采用預(yù)測集均方根誤差(root-mean-squares error of prediction,RMSEP)、相對分析誤差(residual predictive deviation,RPD)等參數(shù)對模型的預(yù)測能力進行評價。研究結(jié)果1 LMWCSs的制備及表征采取氧化降解法、酶解法、酸降解法以及微波輔助堿降解法對鯊魚來源、豬來源和牛來源的CS進行降解共獲得12種LMWCSs。FTIR結(jié)果顯示LMWCSs和CS的骨架結(jié)構(gòu)一致；采用HPLC進行雙糖分析,結(jié)果表明不同來源的雙糖組成不同,同種來源的CS和LMWCS組成相同,不同的降解方法對硫酸根的損失不同,酸降解和微波輔助堿降解的硫酸根丟失嚴(yán)重,氧化降解和酶降解對硫酸根含量影響不大；采用紫外分析表明酶解法產(chǎn)生的LMWCSs含有不飽和糖醛酸結(jié)構(gòu)；NMR結(jié)果表明酶降解法的LMWCSs的非還原端產(chǎn)生了不飽和糖醛酸,而其它LMWCSs的非還原端結(jié)構(gòu)與未降解的CS一致；分子排阻色譜-多角度激光散射測定LMWCSs的重均相對分子質(zhì)量(廚w)的結(jié)果表明,通過利用不同的方法制備了廚w在1217 Da到8085 Da的LMWCSs.2不同LMWCSs的抗補體活性研究與構(gòu)效關(guān)系對LMWCSs的結(jié)構(gòu)和活性之間的關(guān)系進行研究。結(jié)果表明,利用鯊魚來源的CS采用氧化降解的方法制備的LMWCS(LMWCS-S-O)具有更好的抗補體活性。對于LMWCSs與抗補體活性進行構(gòu)效分析表明：△Di-2,6diS,△Di-4,6diS和△Di-6S雙糖結(jié)構(gòu)有利于提高LMWCS的抗補體活性,而△Di-6S和△Di-OS不利于提高抗補體活性。LMWCS-S-O在緩解、治療OA中可能具有更好的療效。并且選擇出具有較好活性的LMWCS-S-O和較低活性的豬來源CS(CS-P)進行進一步的活性研究。3 LMWCS對軟骨細(xì)胞的影響采用ELISA的方法研究LMWC S對補體替代途徑激活過程中C3沉積的結(jié)果表明,LMWCS-S-O在400 μg/mL時可以顯著性地抑制C3b的產(chǎn)生,從而抑制替代途徑激活。而豬來源CS(CS-P)在1.2mg/mL時才顯著性的抑制替代途徑；對提取的軟骨細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)和阿利新藍染色結(jié)果表明軟骨細(xì)胞提取正確；MTT實驗表明在500 μg/mL的濃度下,LMWCS-S-O和CS-P對軟骨細(xì)胞并沒有毒性；補體介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞死亡的實驗結(jié)果表明400 μg/mL的LMWCS-S-O可以顯著性地抑制補體活性保護軟骨細(xì)胞；RT-PCR的結(jié)果表明,LMWCS-S-O可以顯著性地抑制由脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞C3mRNA水平,從而抑制軟骨細(xì)胞的C3表達水平。4 LMWCS對實驗性骨性關(guān)節(jié)炎的影響通過利用DMM的方法成功的建立了小鼠OA模型；小鼠支撐力結(jié)果表明LMWCS-S-O可以顯著性地緩解OA帶來的疼痛。番紅固綠染色結(jié)果表明LMWCS-S-O可以減少小鼠骨關(guān)節(jié)表面軟骨的損失,緩解OA的進程；ELISA和免疫組化的結(jié)果表明LMWCS-S-O可以抑制C5b-9的水平,其可以通過調(diào)節(jié)補體活性實現(xiàn)緩解、治療OA的作用。CS-P同樣表現(xiàn)出了緩解OA的效果,但作用不顯著。5基于近紅外光譜分析技術(shù)的硫酸軟骨素抗補體活性快速篩選方法的建立通過漫反射方式采集了60個不同來源、不同Mw的CS樣品的光譜,并利用溶血法測定其一級數(shù)據(jù)(IC50)；利用因子設(shè)計實驗選擇了一階導(dǎo)數(shù)-SNV-SG亞滑-MC的最佳預(yù)處理方法；利用CARS法選擇了47個變量建立PLS模型；模型的校正集的相關(guān)系數(shù)Rc=0.983,驗證集的相關(guān)系數(shù)Rp=0.969,驗證集的RMSEP=0.376 mg,RPD=5.46,建立的模型可以用于CS的抗補體活性篩選。結(jié)論和意義通過本研究制備了一系列的LMWCSs,研究了LMWCSs與抗補體活性之間的構(gòu)效關(guān)系,揭示△Di-2,6diS,△Di-4,6diS和△Di-6S雙糖結(jié)構(gòu)有利于提高LMWCS的抗補體活性,在緩解、治療OA中可能具有更好的效果。并對LMWCS-S-O通過調(diào)節(jié)補體活性緩解OA進行了體外、體內(nèi)的初步探索,證明鯊魚來源LMWCS具有通過調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)防治OA的潛在的藥用價值。最后建立CS抗補體活性的快速篩選方法,有利于實現(xiàn)CS抗補體活性的快速篩選。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943;R96
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本文編號：2489017