【摘要】：近年來(lái),PRKAR1A被越來(lái)越多的研究者所關(guān)注,因?yàn)槠涫Щ钚酝蛔兛梢詫?dǎo)致以心臟粘液瘤和內(nèi)分泌系統(tǒng)多發(fā)腫瘤為主要臨床表現(xiàn)的Carney綜合征的發(fā)生,所以被廣泛認(rèn)為是一個(gè)抑癌基因。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明,PRKAR1A的突變可以導(dǎo)致多種內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生。同時(shí)越來(lái)越多的證據(jù)表明,雖然PRKAR1A在非家族性內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤的患者中基因突變的發(fā)生率并不高,但其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平發(fā)生的表達(dá)水平下調(diào)也在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起到一定作用,目前具體機(jī)制尚未明確。PRKAR1A的表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致PKA活性的異常升高,從而激活PKA通路,因此我們認(rèn)為PRKAR1A-PKA通路的變化有可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到一定作用。為驗(yàn)證PRKAR1A-PKA通路在心臟粘液瘤和內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用,我們分別在個(gè)體水平(家族性心臟粘液瘤)、整體水平(19例心臟粘液瘤分析)和細(xì)胞水平(乳腺癌細(xì)胞系)進(jìn)行分析,并對(duì)其致病機(jī)制做初步探討。目的:分析、并證明PRKAR1A-PKA在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用,并探討其機(jī)制。方法:(1)由PRKAR1A剪切位點(diǎn)突變導(dǎo)致Carney綜合征家系的臨床及基礎(chǔ)研究1)通過(guò)對(duì)家系成員臨床資料和遺傳學(xué)資料的研究,了解疾病在家系中的發(fā)病頻率和遺傳學(xué)特點(diǎn)。2)通過(guò)外顯在捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)先證者血樣標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序,并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析,通過(guò)對(duì)SNPs和In Dels位點(diǎn)的分析,確定疾病的責(zé)任基因,并分析其可能對(duì)PRKAR1A轉(zhuǎn)錄翻譯的影響。3)抽取全部家系成員外周血,根據(jù)上一步實(shí)驗(yàn)找到的可疑位點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行一代測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與家系遺傳學(xué)特點(diǎn)相比較,驗(yàn)證可疑突變位點(diǎn)是否導(dǎo)致疾病。4)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)在m RNA水平分析突變位點(diǎn)對(duì)PRKAR1A轉(zhuǎn)錄的影響。5)在先證者腫瘤組織中檢測(cè)PRKAR1A表達(dá)情況,分析突變位點(diǎn)對(duì)翻譯的影響。(2)PRKAR1A在心臟粘液瘤中的作用及機(jī)制研究1)共收集19例非家族性非Carney綜合征的心臟粘液瘤患者的粘液瘤標(biāo)本。2)對(duì)19例粘液瘤樣本中PRKAR1A的m RNA水平進(jìn)行半定量檢測(cè),分析PRKAR1A在非家族性非Carney綜合征的心臟粘液瘤患者腫瘤中的轉(zhuǎn)錄情況。3)應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)在心臟粘液瘤中PRKAR1A蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)應(yīng)用PRKAR1A的C端抗體和N端抗體,初步判斷是否存在結(jié)構(gòu)異常。4)應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)CREB和ATF2蛋白的表達(dá)水平,并通過(guò)其磷酸化程度的變化評(píng)估其與PRKAR1A-PKA之間的聯(lián)系。5)對(duì)7例心臟粘液瘤患者粘液瘤的PRKAR1A基因進(jìn)行目的外顯子捕獲測(cè)序,并對(duì)突變位點(diǎn)應(yīng)用一代測(cè)序在腫瘤組織和外周血中進(jìn)行驗(yàn)證。(3)PRKAR1A-PKA通路在乳腺癌中的作用及機(jī)制研究1)應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)6組乳腺癌樣本中PRKAR1A表達(dá)情況。2)驗(yàn)證依托泊苷在體外對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系的殺傷作用,并通過(guò)MTT確定依托泊苷的工作濃度和工作時(shí)間。3)應(yīng)用Westurn blot方法檢測(cè)CREB磷酸化程度,確定PKA抑制劑H89和PKA激活劑Forskolin的工作濃度和工作時(shí)間。4)通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CREB和ATF2的磷酸化程度,明確PKA激活劑Forskolin對(duì)CREB和ATF2活化程度的影響。5)分別加入H89、Forskolin、Forskolin+PKC抑制劑,明晰PKA、PKC通路對(duì)人乳腺癌細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性的影響。6)提取細(xì)胞核蛋白,檢測(cè)H89、Forskolin、Forskolin+PKC抑制劑對(duì)CREB和ATF2活化入核的影響。7)揭示H89、Forskolin、Forskolin+PKC抑制劑對(duì)BCL2表達(dá)水平的影響。結(jié)果:(1)由PRKAR1A剪切位點(diǎn)突變導(dǎo)致的Carney綜合征家系的臨床及基礎(chǔ)研究1)家系圖和臨床癥狀表明,整個(gè)家系中先證者和母親可被確診為Carney綜合征。2)通過(guò)外顯子捕獲測(cè)序,我們共確定了130個(gè)SNPs位點(diǎn)和3個(gè)插入/刪除突變位點(diǎn)。其中3個(gè)In Del位點(diǎn)均可引起移碼突變,包括NF1的第55外顯子(c.8075dup G),PRKAR1A第六外顯子(c.549+1del G)和RECQL1第15內(nèi)含子(c.2297-1del G)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,我們認(rèn)為PRKAR1A第六外顯子(c.549+1del G)是本家系的致病基因。3)一代測(cè)序結(jié)果表明,先證者和母親發(fā)生突變,突變形式完全一樣,而父親和哥哥的測(cè)序樣本中均未發(fā)現(xiàn)突變。突變結(jié)果與臨床表現(xiàn)完全符合。4)逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示,母親和先證者的樣本中發(fā)現(xiàn)了包含未剪切的第六內(nèi)含子的m RNA。對(duì)PCR產(chǎn)物的堿基序列進(jìn)行分析后證明,該家系中的PRKAR1A突變可以在翻譯時(shí)在185號(hào)纈氨酸后發(fā)生移碼突變,在繼續(xù)編碼9個(gè)新的氨基酸后提前出現(xiàn)終止子TGA。5)Western blot結(jié)果顯示,先證者的粘液瘤組織中PRKAR1A分子量正常,但在粘液瘤組織中PRKAR1A的表達(dá)量與對(duì)照組(正常心肌組織)相比明顯下降(P0.05)。說(shuō)明變異的m RNA未被翻譯。產(chǎn)生疾病的原理是無(wú)意義m RNA降解作用導(dǎo)致的PRKAR1A表達(dá)下降。(2)PRKAR1A在心臟粘液瘤中的作用及機(jī)制研究1)PRKAR1A的m RNA水平在心臟粘液瘤中明顯降低。2)PRKAR1A蛋白在心臟粘液瘤中含量明顯減少(包括C端和N端抗體結(jié)果)。3)p CREB/CREB和p ATF2/ATF2在腫瘤組織中表達(dá)均明顯升高。4)CREB磷酸化水平的升高與PRKAR1A的表達(dá)下調(diào)呈弱相關(guān),但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5)超過(guò)21%的非家族性心臟粘液瘤存在PRKAR1A失活性突變率,超過(guò)54%的非家族性心臟粘液瘤PRKAR1A表達(dá)下降與PRKAR1A失活性突變有關(guān),并且這種突變是腫瘤組織特有的,在外周血中并未發(fā)現(xiàn),可能是心臟粘液瘤發(fā)生的主要原因。(3)PRKAR1A-PKA通路在乳腺癌中的作用及機(jī)制研究1)乳腺癌組織中的PRKAR1A突變率不高,但與癌旁組織相比乳腺癌樣本中PRKAR1A表達(dá)明顯下降(P=0.024)。2)依托泊苷在體外對(duì)MDA-MB-231、MCF7細(xì)胞系殺傷作用明確,最佳工作條件分別為200 n M(24小時(shí))和500 n M(12小時(shí))3)給予PKA激活劑或抑制劑可以改變CREB磷酸化水平,PKA抑制劑H89工作條件為2μM,1小時(shí),PKA激動(dòng)劑Forskolin工作條件為2μM,2小時(shí)。4)PKA激動(dòng)劑Forskolin處理乳腺癌細(xì)胞后,p CREB/CREB呈逐漸升高趨勢(shì),p ATF2/ATF2呈先升高后下降趨勢(shì),其中p ATF2(Thr 71)/ATF2達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)間要比p ATF2(Thr52)/ATF2晚。5)依托泊苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用可以被PKA抑制劑增強(qiáng),也可以被PKA激活劑減弱。但是Forskolin對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用可以部分被PKC抑制劑拮抗。6)PKA活性增加可以使核內(nèi)CREB和ATF2水平增加。其中ATF2的增加可被PKC抑制劑拮抗,并且增加乳腺癌細(xì)胞系對(duì)依托泊苷的敏感性。7)PKA的活性增高可以使BCL2表達(dá)增多,這種增多可能是激活的ATF2介導(dǎo)的,并可以被RO31-8220部分拮抗。結(jié)論:總之,PRKAR1A是一個(gè)抑癌基因,各種原因?qū)е碌钠涫Щ钚酝蛔兓虮磉_(dá)下調(diào)均可能導(dǎo)致遺傳性疾病以及是多種腫瘤的發(fā)生。PRKAR1A表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致PKA活性的異常升高,通過(guò)直接激活CREB和間接激活(AKT、ERK、PKC)ATF2促進(jìn)其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移激活其下游基因如BCL2的表達(dá),并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性,可能在心臟粘液瘤、乳腺癌及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 程智廣,余翼飛,朱朗標(biāo),王冬青,李功宋;復(fù)發(fā)性心臟粘液瘤的外科治療[J];中華外科雜志;2000年11期

2 李紅昕,郭蘭敏,馬家駒,范全心,鄒承偉,袁貴道;復(fù)發(fā)性心臟粘液瘤4例[J];中華胸心血管外科雜志;2000年05期

3 張棣,龍偉吟;超聲檢查心臟粘液瘤的意義[J];中國(guó)超聲診斷雜志;2000年01期

4 徐京團(tuán),陳秀慧,孔軍,于龍華,畢素棟;彩色多普勒超聲診斷心臟粘液瘤[J];中國(guó)超聲診斷雜志;2000年01期

5 利慶華;心臟粘液瘤摘除術(shù)的護(hù)理體會(huì)[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2000年S1期

6 劉蘇,周洪昌,王亞宏,肖志偉,李斌;30例心臟粘液瘤報(bào)告[J];心肺血管病雜志;2000年03期

7 李旭東,蔣佩明,劉志勇,楊丹寧;心臟粘液瘤的診斷及外科治療[J];徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2000年02期

8 王曉明,郭蘭敏,張慧;心臟粘液瘤的診斷與外科治療(附71例報(bào)告)[J];山東醫(yī)藥;2001年10期

9 王繼征,王鳳,趙躍青,李廣軍;家族性心臟粘液瘤2例[J];中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志;2001年01期

10 易建陽(yáng),王淦,翁品光,張青海,陳保俊,曹彬;心臟粘液瘤的診斷與治療[J];江蘇醫(yī)藥;2001年09期

相關(guān)會(huì)議論文 前9條

1 王茹;;超聲診斷心臟粘液瘤12例報(bào)告[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)急診醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)第六次全國(guó)急診醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];1996年

2 羅立國(guó);景華;胡小南;李忠東;李德閩;;心臟粘液瘤的診斷與外科治療[A];第八屆華東六省一市胸心血管外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

3 王建堂;馬增山;馬勝軍;董銘鋒;馮致余;柴守棟;唐培哲;;心臟粘液瘤的外科治療[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)胸心血管外科學(xué)術(shù)會(huì)議暨2007中華醫(yī)學(xué)會(huì)胸心血管外科青年醫(yī)師論壇論文集心血管外科分冊(cè)[C];2007年

4 李靖;劉延玲;王劍鵬;呂秀章;朱振輝;;超聲心動(dòng)圖在心臟粘液瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)超聲醫(yī)學(xué)新進(jìn)展學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

5 王春利;鄒潔凈;郭春花;;老年心臟粘液瘤手術(shù)期護(hù)理[A];全國(guó)第六屆老年護(hù)理學(xué)術(shù)交流專題講座會(huì)議論文匯編[C];2003年

6 劉文旭;李治安;孫琳;侯曉彤;何怡華;房芳;;心臟粘液瘤的超聲心動(dòng)圖診斷(附139例手術(shù)對(duì)照)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)超聲醫(yī)學(xué)新進(jìn)展學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

7 楊麗華;;心臟粘液瘤圍術(shù)期的護(hù)理[A];全國(guó)第二屆重癥監(jiān)護(hù)護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會(huì)議論文匯編[C];2005年

8 王哲;陳安清;周光華;趙強(qiáng);;心臟粘液瘤和粘液肉瘤153例的外科治療[A];第八屆華東六省一市胸心血管外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

9 李軍;張軍;李紅玲;朱霆;;巨大靜脈血管平滑肌瘤病的超聲診斷與鑒別[A];中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第三次全國(guó)淺表器官及外周血管超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議（高峰論壇）論文匯編[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院教授 羅學(xué)宏;警惕心臟粘液瘤“流竄”作惡[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 孫云鵬;PRKAR1A-PKA通路在心臟粘液瘤和乳腺癌中的作用及其機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 鄭松;心臟粘液瘤的外科治療[D];浙江大學(xué);2004年

2 紀(jì)藍(lán);77例心臟粘液瘤患者臨床回顧性分析[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

3 鄧文海;Carney綜合征—附一例報(bào)告[D];浙江大學(xué);2008年

，

本文編號(hào)：2479926