【摘要】：目的:本實驗以人髓系白血病細胞系K562、HL60及其耐藥細胞系K562/A02和HL60/ADR為體外研究模型,探討PI3K抑制劑ZSTK474對人白血病細胞的抗腫瘤作用和分子機理,并在此基礎(chǔ)上,進一步探討了ZSTK474與白血病化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用以及ZSTK474的逆轉(zhuǎn)耐藥機制。本文首次系統(tǒng)報道了ZSTK474單用及與化療藥物聯(lián)合用藥對急性、慢性白血病的體外治療作用,為PI3K抑制劑類新型抗白血病藥物的開發(fā)及應(yīng)用于治療白血病提供了理論依據(jù)和初步實驗基礎(chǔ)。本文分為三個部分:第一部分為ZSTK474體外抗白血病活性研究;第二部分為ZSTK474與白血病化療藥物的聯(lián)合用藥研究;第三部分為ZSTK474逆轉(zhuǎn)耐藥性機制研究。方法:1、利用MTT法、軟瓊脂克隆形成實驗檢測ZSTK474對K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR細胞的抗增殖活性。2、利用流式細胞術(shù)檢測ZSTK474對K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR細胞周期分布、凋亡的影響。3、采用western-blot檢測ZSTK474對K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR細胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1、p27、pRb等因子表達及磷酸化水平的影響。同時還采用該法檢測了ZSTK474干預前后細胞中PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵因子PDK-1、Akt、GSK-3β的磷酸化水平。4、采用qRT-PCR法檢測了ZSTK474對K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR細胞中p27 mRNA表達水平的影響。5、采用Chou-Talalay法結(jié)合CalcuSyn軟件分析了ZSTK474與不同化療藥物聯(lián)合應(yīng)用后的藥物聯(lián)合系數(shù)(combination index,CI),進行聯(lián)合用藥效果評價。6、通過檢測底物蓄積,如ADR蓄積和5-CFDA外排,評價ZSTK474對K562/A02和HL60/ADR細胞中耐藥蛋白MDR1和MRP1功能的影響;采用western-blot法研究了ZSTK474干預前后兩種耐藥細胞中耐藥蛋白MDR1和MRP1表達水平變化。結(jié)果:1、MTT實驗結(jié)果顯示ZSTK474能夠劑量依賴性地抑制K562、HL60及其耐藥細胞K562/A02、HL60/ADR的細胞增殖,其IC50值分別為4.69μM(K562)、1.165μM(HL60)、7.57μM(K562/A02)、1.160μM(HL60/ADR)。軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果也顯示ZSTK474能夠抑制K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR四種細胞的增殖能力,主要表現(xiàn)在克隆數(shù)量和克隆形成率均隨著給藥劑量增高而降低。2、PI染色、流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示ZSTK474干預K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR細胞后,四種細胞均發(fā)生細胞周期G1期阻滯;Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示,ZSTK474干預后四種細胞均未見顯著性細胞凋亡現(xiàn)象。3、Western-blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白表達及磷酸化水平的結(jié)果顯示,ZSTK474處理K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR細胞后,在四種細胞中,p27呈現(xiàn)升表達,cyclinD1呈現(xiàn)降表達,pRb發(fā)生去磷酸化;Western-blot檢測PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵因子水平的結(jié)果顯示,ZSTK474干預四種細胞后,細胞PDK-1、Akt、GSK-3β的磷酸化水平均下降。4、qRT-PCR結(jié)果顯示,ZSTK474處理K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR細胞后,細胞中p27的mRNA水平升高。5、聯(lián)合用藥結(jié)果顯示,對于K562和K562/A02細胞,ZSTK474與Imatinib聯(lián)合用藥在ED50、ED75、ED90下的CI分別為0.37,0.39,0.54和0.08,016,0.39;對于HL60和HL60/ADR細胞,ZSTK474與阿糖胞苷聯(lián)合用藥在ED50、ED75、ED90下的CI分別為0.73,0.35,0.24和0.42,0.64,1.17。ZSTK474與長春新堿聯(lián)合用藥在ED50、ED75、ED90下的CI分別為0.76,1.08,1.67和0.25,0.70,2.03。ZSTK474與高三尖杉酯堿聯(lián)合用藥在ED50、ED75、ED90下的CI分別為0.68,0.57,0.67和0.96,1.62,2.75。6、ZSTK474處理K562/A02、HL60/ADR細胞后,底物蓄積檢測結(jié)果顯示,兩種細胞中ADR發(fā)生明顯蓄積,HL60/ADR細胞中5-CFDA發(fā)生明顯蓄積;western-blot檢測結(jié)果顯示,兩種細胞中MDR1的表達水平呈現(xiàn)ZSTK474劑量依賴性降低,在HL60/ADR細胞中MRP1的表達也呈現(xiàn)ZSTK474劑量依賴性降低,而在K562/A02細胞中未檢測到MRP1表達。結(jié)論:1、ZSTK474能夠抑制K562、HL60及其耐藥細胞K562/A02、HL60/ADR的增殖、將四種細胞周期阻滯在G1期,且該活性可能是通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的。2、ZSTK474與本實驗中使用的抗白血病化療藥物聯(lián)用在K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR細胞中在ED50下均顯示協(xié)同藥效。3、ZSTK474可能是通過影響K562/A02、HL60/ADR細胞耐藥蛋白MDR1和/或MRP1的表達水平和功能,從而表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)耐藥活性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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本文編號：2474248