【摘要】：血管緊張素Ⅱ是血管緊張素原在腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)的作用下或者通過糜蛋白酶等非ACE途徑形成的八肽化合物。血管緊張素Ⅱ的受體包括1型受體(angiotensin II type1receptor, AT1R)和2型受體(angiotensin II type2receptor, AT2R),二者與血管緊張素Ⅱ的親和力相似。血管緊張素Ⅱ通過AT1R在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著收縮血管、調(diào)節(jié)血壓和水鈉平衡等作用。在高血壓、充血性心力衰竭等心血管疾病治療中廣泛使用的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEIs)和1型受體阻斷劑(angiotensin II type1receptor blockers, ARBs)就是分別通過限制血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生或者阻斷血管緊張素Ⅱ與AT1R受體的結(jié)合來發(fā)揮治療效應(yīng)。單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等炎癥免疫細(xì)胞均擁有獨(dú)立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)。血管緊張素Ⅱ以自分泌或旁分泌的形式與炎癥免疫細(xì)胞上的AT1R作用,通過刺激單核細(xì)胞趨化移行、誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化成熟、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化增殖、增強(qiáng)Thl和Th17免疫功能,進(jìn)而參與炎癥免疫反應(yīng)。血管緊張素Ⅱ在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)等自身免疫病的致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,ACEIs和ARBs分別通過阻斷血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生和其與受體的相互作用,進(jìn)而緩解RA等自身免疫病患者的炎癥免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),在AT2R基因敲除小鼠上建立動(dòng)脈粥樣硬化、腦缺血再灌注損傷、血管損傷重塑的疾病模型,與正常小鼠相比,AT2R的缺失會(huì)導(dǎo)致模型小鼠疾病的惡化。相反,AT2R轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌肥大、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病表現(xiàn)得到了有效地緩解,提示AT2R可能在疾病病程中發(fā)揮保護(hù)性作用。利用藥理學(xué)工具研究發(fā)現(xiàn),AT2R激動(dòng)劑CGP42112和C21具有舒張血管內(nèi)皮、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)再生等作用。一般而言,當(dāng)阻斷血管緊張素Ⅱ與AT1R的結(jié)合時(shí),游離的血管緊張素Ⅱ水平會(huì)隨之增高,并且反饋性的與另一個(gè)受體AT2R作用,繼而發(fā)揮AT2R的保護(hù)性功能,這個(gè)假設(shè)在氯沙坦治療主動(dòng)脈瘤和高血壓腎病的研究中都被予以證實(shí)。目前AT2R在RA及其實(shí)驗(yàn)關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中的作用未見報(bào)道。本課題通過建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis, AIA)模型,探討AT2R在AIA炎癥免疫反應(yīng)中的變化和作用,研究AT2R激動(dòng)劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的治療作用及部分機(jī)制,為發(fā)現(xiàn)AT2R參與調(diào)控RA炎癥免疫反應(yīng)的作用以及成為新靶點(diǎn)的可能性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的： 本課題建立大鼠AIA模型,探討AT2R在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎和RA患者中的變化及其作用,觀察關(guān)節(jié)腔注射AT2R激動(dòng)劑CGP42112對(duì)繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎的治療作用,研究AT2R對(duì)體外培養(yǎng)的AIA大鼠單核細(xì)胞的影響。為明確AT2R在調(diào)控RA炎癥免疫反應(yīng)中的作用以及能否成為治療RA的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法： SD大鼠右后足跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)建立大鼠AIA模型。造模后第14天采用灌胃方式給予AIA大鼠氯沙坦(5,10,15mg/kg),每天給藥1次,療程持續(xù)15天,第28天處死大鼠,甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)(0.5mg/kg)作為陽性對(duì)照藥。觀察大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)和病理組織學(xué)評(píng)價(jià)的變化；采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)大鼠血清、滑膜中腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管緊張素Ⅱ水平的變化。采用Western blot法檢測(cè)大鼠脾臟、滑膜中AT1R、AT2R蛋白的表達(dá),并使用Spearman法分析AIA大鼠ATlR、AT2R蛋白表達(dá)與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的相關(guān)性。分離大鼠外周血的單核細(xì)胞,采用Western blot法檢測(cè)大鼠單核細(xì)胞AT1R,AT2R蛋白的表達(dá)。 收集健康志愿者和12例活動(dòng)期RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),利用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AT1R、AT2R的變化。 建立AIA大鼠模型(方法同上),采用關(guān)節(jié)腔注射AT2R激動(dòng)劑CGP42112(5,10,20μg/kg)觀察其對(duì)AIA大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)炎的治療作用,第14天開始給藥,每隔3天給藥1次,療程持續(xù)15天,以醋酸曲安奈德(triamcinolone acetonide, TA)(1mg/kg)注射液作為陽性對(duì)照藥。觀察大鼠左后足關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹度、病理組織學(xué)評(píng)價(jià)、滑膜組織CD11b陽性細(xì)胞浸潤的變化；分離并體外培養(yǎng)大鼠滑膜細(xì)胞,采用CCK-8試劑盒檢測(cè)滑膜細(xì)胞增殖的變化。 分離并體外培養(yǎng)模型組大鼠單核細(xì)胞,采用Western blot法檢測(cè)CGP42112(10-6M)和氯沙坦(10-6M)對(duì)單核細(xì)胞AT1R、AT2R蛋白表達(dá)的影響;采用CCK-8試劑盒檢測(cè)AT2R激動(dòng)劑CGP42112(10-10至10-5M)對(duì)大鼠單核細(xì)胞活性的影響；采用Transwell法檢測(cè)CGP42112(10-8至10-5M)和氯沙坦(10-6M)對(duì)大鼠單核細(xì)胞趨化的作用。 結(jié)果： 1.AIA大鼠和RA患者的AT2R表達(dá)顯著增高,且AT2R表達(dá)的上調(diào)與AIA大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)減輕相關(guān) 與正常組相比,模型組大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高。對(duì)于滑膜炎的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)表明,模型組大鼠滑膜炎表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腔積液,炎性滲出,滑膜細(xì)胞增生,血管翳形成,滑膜組織內(nèi)小血管增生,大量炎細(xì)胞浸潤,嚴(yán)重者增生的滑膜組織侵犯軟骨表面和軟骨下骨。與正常組相比,ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,模型組大鼠血清和滑膜中TNF-a、VEGF以及血清中血管緊張素Ⅱ的水平顯著升高。Western blot的結(jié)果表明,與正常組相比,模型組大鼠脾臟、滑膜中AT1R和AT2R蛋白的表達(dá)均顯著升高。分離大鼠單核細(xì)胞,Western blot的結(jié)果表明,與正常組相比,模型組大鼠單核細(xì)胞的AT1R、AT2R蛋白表達(dá)均顯著增高。收集RA患者外周血,qPCR的檢測(cè)結(jié)果表明,與健康志愿者相比,RA患者PBMCs的AT1R和AT2R mRNA水平顯著增高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)一步表明,RA患者PBMCs的AT1R和AT2R表達(dá)顯著升高。 第22、26天時(shí),與模型組相比,氯沙坦(10,15mg/kg)組和MTX (0.5mg/kg)組大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低。與模型組相比,氯沙坦(15mg/kg)組和MTX (0.5mg/kg)組大鼠的滑膜細(xì)胞增生、炎細(xì)胞的浸潤和血管翳的出現(xiàn),以及軟骨和骨的侵蝕等滑膜炎病理學(xué)表現(xiàn)得到顯著減輕。與模型組相比,氯沙坦(5,10,15mg/kg)組和MTX (0.5mg/kg)組大鼠的TNF-α、VEGF、血管緊張素Ⅱ水平均得到不同程度的降低。與模型組相比,氯沙坦(5,10,15mg/kg)組和MTX (0.5mg/kg)組大鼠脾臟、滑膜中AT1R蛋白的表達(dá)不同程度顯著降低；氯沙坦(10,15mg/kg)組大鼠脾臟、滑膜中AT2R蛋白的表達(dá)不同程度顯著升高。與模型組相比,氯沙坦(15mg/kg)組大鼠單核細(xì)胞的AT1R蛋白表達(dá)顯著降低、AT2R蛋白表達(dá)顯著增高。對(duì)AIA大鼠AT1R、AT2R蛋白表達(dá)與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的相關(guān)性分析表明,脾臟、滑膜中AT1R蛋白表達(dá)與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈正相關(guān),即AT1R蛋白表達(dá)的上調(diào)與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的增高相關(guān)；而脾臟、滑膜中AT2R蛋白表達(dá)與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈負(fù)相關(guān),即AT2R蛋白表達(dá)的上調(diào)與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的減輕相關(guān)。 2.關(guān)節(jié)腔注射CGP42112時(shí),激動(dòng)AT2R可以緩解AIA大鼠體內(nèi)的繼發(fā)側(cè)炎癥免疫反應(yīng) 初步研究表明AT2R參與了AIA和RA的疾病病程,且高表達(dá)的AT2R與大鼠關(guān)節(jié)炎的緩解密切相關(guān),為了明確AT2R在調(diào)控AIA炎癥免疫反應(yīng)中的作用,因此我們?cè)谡w給藥的情況下進(jìn)一步研究左后足踝關(guān)節(jié)腔注射AT2R激動(dòng)劑CGP42112對(duì)AIA大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)炎的作用。與正常組相比,模型組大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高；第22、26天時(shí),與模型組相比,CGP42112(10,20μg/kg)組和TA(1mg/kg)組大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低。與正常組相比,模型組大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)腫脹度顯著升高；第22、26天時(shí),與模型組相比,CGP42112(10,20μg/kg)組和TA (1mg/kg)組大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低。組織病理學(xué)評(píng)價(jià)表明,與模型組相比,CGP42112(20μg/kg)組和TA (1mg/kg)組大鼠滑膜炎各單項(xiàng)的病理學(xué)評(píng)分包括滑膜細(xì)胞增生、炎細(xì)胞的浸潤和血管翳的出現(xiàn),以及軟骨和骨的侵蝕均顯著減輕。免疫組化結(jié)果表明,與模型組相比,CGP42112(20μg/kg)組和TA (1mg/kg)組大鼠的滑膜組織CDllb陽性細(xì)胞浸潤明顯減輕。與正常組相比,模型組大鼠的滑膜細(xì)胞顯著增殖；與模型組相比,CGP42112(10,20μg/kg)組和TA (1mg/kg)組大鼠的滑膜細(xì)胞增殖受到顯著抑制。 3.激動(dòng)AT2R抑制體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞活性 為了探討激動(dòng)AT2R緩解AIA大鼠炎癥免疫反應(yīng)的作用機(jī)制,我們分離并體外培養(yǎng)模型組大鼠單核細(xì)胞,Western blot的檢測(cè)結(jié)果表明,CGP42112(10-6M)和氯沙坦(10-6M)顯著降低單核細(xì)胞AT1R蛋白的表達(dá),顯著升高大鼠單核細(xì)胞AT2R蛋白的表達(dá)。CCK-8檢測(cè)的結(jié)果表明,AT2R激動(dòng)劑CGP42112(10-10至10-5M)對(duì)大鼠單核細(xì)胞的活性發(fā)揮不同程度的抑制作用,其半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration50%, IC50)的值為5.21×10-6M。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果表明,CGP42112(10-7至10-5M)和氯沙坦(10-6M)顯著減弱胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和IL-1p誘導(dǎo)的大鼠單核細(xì)胞趨化。 結(jié)論： 1.AIA大鼠脾臟、滑膜組織及單核細(xì)胞和RA患者外周血中AT2R表達(dá)顯著升高,且AT2R表達(dá)上調(diào)與AIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)減輕相關(guān),提示AT2R在RA病程進(jìn)展中可能發(fā)揮緩解炎癥免疫反應(yīng)的作用。 2.關(guān)節(jié)腔注射CGP42112改善AIA大鼠繼發(fā)側(cè)左后足的關(guān)節(jié)滑膜炎,抑制滑膜細(xì)胞增殖,驗(yàn)證激動(dòng)AT2R可以緩解AIA炎癥免疫反應(yīng),提示AT2R可能成為RA治療的新靶點(diǎn)。 3.CGP42112上調(diào)AIA大鼠單核細(xì)胞AT2R的蛋白表達(dá),激動(dòng)AT2R可抑制體外培養(yǎng)的AIA大鼠單核細(xì)胞活性,提示激動(dòng)AT2R可能通過抑制單核細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)發(fā)揮對(duì)AIA的治療作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96

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