【摘要】：在人類生產生活中,濫用抗生素引起了細菌抗藥性的增強,導致產生了超級耐藥細菌。其典型例子是,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)和耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus, VRE)的爆發(fā)。MRSA是一種最致命的超級耐藥細菌,它能導致心內膜炎、肺炎和敗血癥等疾病。從發(fā)現(xiàn)至今,MRSA感染幾乎遍及全球,已成為醫(yī)院內和社區(qū)感染的重要病原菌之一。VRE屬于腸球菌屬,對多種抗生素均有耐藥性,尤其是萬古霉素。VRE的感染也造成許多致命的健康問題,如多器官功能障礙綜合征(multiorgan dysfunction syndrome, MODS)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS),失血性休克和肺炎等。由此可見目前人類迫切需要開發(fā)更有效的新型抗菌劑來治療MRSA和VRE的感染。近年來,蝎毒液已被證明是一個豐富的抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPS)的來源�？咕脑谛碌目咕幬镩_發(fā)研究中備受關注,因為它可以殺死多重耐藥性病原菌。抗菌肽具有廣譜抗菌活性、不易產生耐藥性和毒性低等特點。目前,已發(fā)現(xiàn)至少60多種蝎毒素抗菌肽。實驗證明,這些抗菌肽均可以殺死革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌、真菌、病毒和腫瘤細胞。我們采用轉錄組學方法,從非洲黃爪蝎(Opistophthalmw glabrifrons)毒腺cDNA文庫中隨機挑選了80個克隆子進行測序。除去低質量的序列,共獲得了66條有效序列進行分析。其中38個克隆子編碼毒素多肽,28個克隆子編碼細胞蛋白(非毒素)。對這些新毒素多肽進行序列分析得到19個新多肽(包含2個鉀毒素、1個陰離子多肽和16個抗菌肽)。根據(jù)這些多肽的序列同源性,我們將獲得的多肽分為4個不同的家族：蝎短鏈鉀離子通道毒素(Short-chain potassium channel toxins, ScKTxs)、蝎長鏈鉀離子通道毒素(Long-chain potassium channel toxins, LcKTxs)、蝎抗菌肽(Antimicrobial peptides)和蝎陰離子多肽(Acidic peptides)。其中抗菌肽豐度最高,總共獲得了16個新的抗菌肽。我們鑒定到了1個陰離子多肽,命名為Osa-1。Osa-1的前體由76個氨基酸殘基組成,信號肽和成熟肽分別由24、52個氨基酸殘基組成。在毒素多肽序列中鑒定到的鉀毒素有2個,其中一個為長鏈鉀毒素(OsKTx-1),一個為短鏈鉀毒素(OsKTx-2)我們對從非洲黃爪蝎毒腺中分離出的一個新的抗菌肽Opisin進行了功能研究。Opisin前體由22個氨基酸殘基的信號肽、19個氨基酸殘基的成熟肽和35個氨基酸殘基的前肽組成。它是一種陽離子兩親性α-螺旋分子。多序列同源性分析結果表明,Opisin與從Mesobuthus eupeu中分離的Meucin-18、Mesobuthus gibbosus中分離的Megicin-18、 Mesobuthus martensii中分離的Marcin-18、Isometrus maculate中分離的Imcroporin、 Androctonus crassicauda中分離的AcrAP2、Tityus Costatus中分離的Clone5和Clone6的同源性為42.1～15.8%之間。Opisin還與從Mesobuthus martensii Karsch中分離的Bmkb1和Bmkb2、Androctonus amoreuxi中分離的AamAP1和AamAP2、Androctonus crassicauda中分離的AcrAP1、T. Costatus中分離的Clone4、Tityus serrulatus中分離的TsAP-1和TsAP-2、Chaerilus Tricostatus中分離的Ctriporin、Lychas mucronatus中分離的Mucroporin有15.0～5.3%的同源性。Opisin對5種革蘭氏陽性菌的抗菌活性分別進行檢測(i)S. Aureus (AB 94004), (ii) Bacillus megaterium (AB 90008), (iii) Bacillus thuringiensis (AB 93100), (iv) Nocardia corallina (AA 92100), 和(v) Micrococcus luteus (AB 2010179)。我們發(fā)現(xiàn)Opisin能夠有效地抑制S. Aureus和N. corallina生長,其MICs值分別為4.0和4.0μM。Opisin對B. Thuringiensis (MIC 6.0μM), M. Luteus (MIC 8.0 μM)和B. Megaterium (MIC 10.0 μM)具有較弱的抗菌活性。我們同樣測試了Opisin對7個革蘭氏陰性菌的抗菌活性(i) E. coli DH5a, (ii) Pseudomonas putida, (iii) Pseudomonas aeruginosa (AB 93066), (iv) Enterobacter cloacae (AB2010162), (v) Klebsiella oxytoca (AB 2010143), (vi) Pseudomonas fluorescens, (vii) Salmonella enterica (AB 2010185)和(viii)真菌Candida tropicalis AY91009。我們發(fā)現(xiàn)Opisin對E. coli DH5a, P. Putida和P. aeruginosa AB 93066具有中等的抗菌活性,MIC值分別為20.0、20.0和20.0μM。然而,抗菌肽Opisin的濃度為少于等于38.2μM時,對E. Cloacae、. S. Enterica、K. Oxytoca和P. Fluorescens沒有明顯的抗菌活性�？咕腛pisin還能有效抑制真菌C. tropicalis AY 91009的生長,MIC值為20.0μM。因此,Opisin對革蘭陽性菌的抗菌活性高于革蘭陰性菌。有趣的是,Opisin能夠有效抑制多重耐藥菌的生長,如對耐甲氧西林菌株MRSA和耐萬古霉素腸球菌菌株VRE。實驗結果表明,Opisin對Sau有很強的抗菌活性,其MIC值為2.0μM；它同樣對被測試的其他耐甲氧西林菌株有很強的抗菌活性,包括16436、16465、16558、16559、16585和16760,其MIC值均為4.0 μM。Opisin對耐萬古霉素腸球菌菌株也有很強的抗菌活性,對菌株E147、E161、E179、S13、E11、E128和E156的MIC值分別為4.0、4.0、4.0、4.0、6.0、6.0和6.0μM。因此,Opisin能用于有關治療MRSA以及VRE感染的藥物開發(fā),為棘手的人類耐藥菌引起的疾病的治療提供新的思路。以Opisin為模板,選取影響抗菌肽抑菌活性的凈電荷和疏水性這兩個重要參數(shù)為改變對象,設計一系列的抗菌肽,進一步測定它們的抑菌活性,總結電荷、疏水性與肽抗菌活性之間的規(guī)律。母肽Opisin的兩個丙氨酸(A)均替換成具有強疏水性的亮氨酸(L),合成出抗菌肽Opisin_M1。同時,把母肽Opisin的較弱疏水性的兩個甲硫氨酸(M)替換成較強疏水性的亮氨酸(L),合成出抗菌肽Opisin_M2�？咕鷮嶒灲Y果表明Opisin_M2對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均有抗菌活性。在試驗的革蘭氏細菌之中,Opisin_M2對Staphylococcus aureus AB 94004, Nocardia corallina AA 92100, Bacillus thuringiensis AB93100和Micrococcus luteus AB 2010179有顯著的抑菌效果,最小抑菌濃度均為4.0μM。Opisin_M3是通過將Opisin α-螺旋結構的極性面中的甘氨酸(G)、色氨酸(W)和絲氨酸(S)均替換成具有正電荷的賴氨酸(K),非極性面不變設計而成的衍生肽。Opisin_M4是通過將Opisin α-螺旋結構的極性面中的色氨酸(W)替換成具有正電荷的賴氨酸(K)非極性面不變設計而成的衍生肽。Opisin_M5是通過將Opisin α-螺旋結構的極性面中的色氨酸(W)和絲氨酸(S)均替換成具有正電荷的賴氨酸(K),非極性面不變設計而成的衍生肽�？咕鷮嶒灲Y果表明Opisin_M4和Opisin_M5對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均有抗菌活性。在試驗的革蘭氏細菌之中,Opisin_M4和Opisin_M5對Micrococcus luteus AB 2010179, Bacillus megaterium AB 90008和Escherichia coli DH5a有顯著的抑菌效果,最小抑菌濃度都分別為4.0 μM、4.0 μM和8.0μM。最后我們把Opisin抗菌肽分子疏水面的疏水性比較低的丙氨酸(A)替換成疏水性最強的異亮氨酸(I),合成衍生肽Opisin_M6。再以Opisin作為模板,刪除S尾巴,合成衍生肽Opisin_M7�？咕鷮嶒灲Y果表明Opisin_M6和Opisin_M7對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均有抗菌活性。在試驗的革蘭氏細菌之中,Opisin_M6和Opisin_M7都對Nocardia corallina AA 92100, Bacillus thuringiensis AB93100和Escherichia coli DH5a有顯著的抑菌效果,最小抑菌濃度都分別為4.0 μM、4.0μM和8.0μM。此外,衍生肽Opisin_M3、Opisin_M4和Opisin_M5在活性濃度范圍內溶血率低于10%。綜上,肽的抑菌活性與肽的疏水性、凈電荷數(shù)量以及二級結構等參數(shù)密切相關。通過序列同源性搜索從Centruroides exilicauda基因組序列篩選到一個新的抗菌肽CeAP1。CeAP1前體由22個氨基酸殘基組成的信號肽序列,17個氨基酸殘基組成的成熟肽序列以及35個氨基酸殘基組成的前肽序列組成。CeAP1與其它蝎源陽離子短鏈抗菌肽序列同源性范圍是82%～42%�？咕V結果顯示CeAP1主要作用于革蘭氏陽性菌,其對耐藥菌MRSA和VRE的MIC值在16～32μM之間。CeAP1溶血活性適中,對人紅細胞的Hc50為52μM。分子進化分析結果顯示短鏈陽離子抗菌肽普遍存在于不同蝎種毒液中,CeAP1與其它來源于新大陸蝎種多肽聚在一起,表明短鏈陽離子抗菌肽基因出現(xiàn)在蝎毒液的時間早于新世界和舊世界蝎種物種分歧時間。氨基酸位點選擇壓力分析結果顯示,蝎短鏈陽離子抗菌肽基因整體存在很強的進化選擇,不同方法共檢測到兩個負選擇位點和一個正選擇位點。這些位點為設計新的抗菌肽突變體提供了新的理論基礎和分子依據(jù)。
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【學位授予單位】：中國地質大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R914

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本文編號：2451064