【摘要】：目的評估組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)-異羥肟酸,(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)對肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活相關(guān)生物學(xué)行為及分子標(biāo)記的影響,并探討相關(guān)的分子機制。方法本研究中的各項實驗均在具有激活HSCs表型的人HSCs系LX2中進行。1.熒光實時定量PCR(q PCR)和Western Blots(WB)在mRNA和蛋白質(zhì)表達水平檢測SAHA對HSCs的α肌動蛋白(αSMA)和膠原蛋白I型(collagen I)等HSCs激活分子標(biāo)志表達的影響。2.通過5-ethynyl-20-deoxyuridine(EdU)摻入法和transwell遷移實驗檢測SAHA對LX2細胞增殖和遷移的影響。3.通過cDNA基因芯片(Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST Array)檢測SAHA作用于HSCs引起的基因表達差異,并利用IPA生物信息學(xué)軟件(Ingenuity Pathway Analysis,http://www.ingenuity.com/products/ipa)進一步挖掘差異基因的生物學(xué)功能和所參與的經(jīng)典信號通路,全面解析SAHA抑制HSCs激活表型的分子機制。4.基于生物信息學(xué)分析結(jié)果,本項研究中我們關(guān)注了高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)信號通路。應(yīng)用si RNA瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)對HMGB1進行基因沉默,評估其在SAHA抑制HSCs激活表型中的作用及其可能的機制。結(jié)果1.q PCR結(jié)果顯示,與未處理組相比,SAHA處理組LX2的αSMA和collagen I的mRNA表達分別下降68.02%(p=0.018)和57.96%(P=0.008)。wb結(jié)果顯示,αsma和cllageni的蛋白水平分別下降了90.80%(p=0.014),和87.30%(p=0.029)。2.edu和transwell結(jié)果顯示,saha處理組lx2細胞的增殖和遷移能力分別比control組下降了76.25%(p=0.021)和77.89%(p=0.003);。3.人類全轉(zhuǎn)錄組基因芯片結(jié)果顯示,saha處理組lx2細胞中504個基因的mrna表達水平呈現(xiàn)兩倍以上的變化,其中與hscs激活密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子κb(nfκb1)的mrna表達下降2.68倍。通過ipa軟件分析上調(diào)和下調(diào)基因的主要生物學(xué)功能和變化顯著的信號通路,上調(diào)基因參與的生物學(xué)功能有:細胞運動,細胞發(fā)育,細胞組裝和組織,細胞功能和維持,細胞生長和增殖,顯著上調(diào)的信號通路有:粘附上皮連接重構(gòu)信號通路,維生素d(1,25-二羥維生素d3)受體(vdr)/類視黃醇x受體(rxr)激活信號通路,過氧化物酶體增殖物活化受體信號通路,支持細胞間連接信號通路;下調(diào)基因參與的生物學(xué)功能有:細胞生長和增殖,細胞死亡和存活,細胞周期,細胞運動,細胞發(fā)育;顯著下調(diào)的信號通路有:hmgb1通路,整合素連接激酶通路,神經(jīng)酰胺信號通路,tec蛋白絡(luò)氨酸激酶信號通路,巨噬細胞內(nèi)一氧化氮產(chǎn)物和活性氧信號通路。其中我們關(guān)注到與hscs激活密切相關(guān)的hmgb1/nfκb(nuclearfactorofkappalightpolypeptidegeneenhancerinbcells)信號通路受到saha顯著抑制。4.檢測saha處理組lx2細胞nfκb的蛋白表達和核轉(zhuǎn)錄活性,驗證saha對nfκb的抑制作用。wb檢測nfκb蛋白表達,結(jié)果顯示:細胞內(nèi)總nfκb1(p50)和p65的蛋白水平分別下降55.0%(p=0.02)和67.0%(p=0.01),雙熒光素酶報告基因(dlr)系統(tǒng)檢測nfκb轉(zhuǎn)錄活性,結(jié)果顯示:saha處理組nfκb相對熒光素酶活性比未處理組下降70.1%(p=0.001)。5.細胞內(nèi)hmgb1在saha抑制nfκb表達和轉(zhuǎn)錄活性中的作用。sirna沉默hmgb1基因后,繼續(xù)用saha2.5μm/l處理lx2細胞48hr,qpcr結(jié)果顯示:nfκb1(p50)的mrna水平接近未處理狀態(tài),提示hmgb1可能是saha引起p50mrna水平下降的決定性因素;同樣條件處理的wb結(jié)果顯示:sirna沉默hmgb1后,saha引起的p65蛋白的表達抑制并無顯著改變(p0.05),而p50蛋白表達為未處理組的73.7%(p=0.001);dlr結(jié)果顯示:單獨saha處理組的nfκb相對熒光強度為未處理組的29%,sirna沉默hmgb1后,saha處理組lx2細胞的nfκb相對熒光強度為的未處理組的53%。sirna沉默hmgb1后,saha處理組lx2細胞的nfκb熒光強度增高為單獨saha處理組的1.76倍。上述結(jié)果提示:細胞內(nèi)的hmgb1對saha引起的nfκb表達和轉(zhuǎn)錄活性抑制起到部分作用。6.SAHA處理組LX2細胞,基因芯片及q PCR結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)HMGB1的mRNA表達發(fā)生變化,進一步WB檢測細胞內(nèi)總體和核內(nèi)的HMGB1蛋白表達,兩者均無明顯變化;細胞免疫熒光顯示HMGB1蛋白由原本在核周聚集變得分散,但整體熒光強度無顯著變化;免疫沉淀提示,SAHA處理組HMGB1蛋白的賴氨酸殘基乙�；潭蕊@著提高。結(jié)論SAHA可以抑制HSCs激活標(biāo)志性分子表達,細胞增殖和遷移等激活相關(guān)生物學(xué)行為。其作用機制可能為依賴HMGB1亞細胞定位和賴氨酸殘基乙�；揎棇�(dǎo)致的SAHA下調(diào)p50表達和NFκB轉(zhuǎn)錄活性的抑制。
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【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96
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本文編號：2450901