【摘要】：目的：吖啶黃作為抗菌藥物曾在臨床上廣泛使用,而近年來其抗腫瘤活性多見諸于報(bào)道,被認(rèn)為是一類具有前景的潛在抗腫瘤藥物。然而針對(duì)吖啶黃抗腫瘤作用機(jī)制的研究并不多見,更缺乏分子靶點(diǎn)的確證,這極大地限制了吖啶黃在抗腫瘤領(lǐng)域中的進(jìn)一步應(yīng)用。本部分研究將以吖啶黃作為研究對(duì)象,通過構(gòu)建基于探針的pull-down系統(tǒng),探討吖啶黃直接結(jié)合的蛋白以及潛在的作用靶點(diǎn)；在此基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)以吖啶黃為主的聯(lián)合用藥方案,考察合用方案的體內(nèi)外抗腫瘤作用,并深入闡述其分子機(jī)制及影響因素。課題旨在發(fā)現(xiàn)吖啶黃全新的作用靶點(diǎn),指導(dǎo)其在腫瘤治療領(lǐng)域的臨床應(yīng)用,為腫瘤治療提供可行的聯(lián)合用藥策略；也為開發(fā)具有類似結(jié)構(gòu)的新型抗腫瘤藥物提供科學(xué)依據(jù)與思路。方法：(1) Pull-down實(shí)驗(yàn)與HPLC-MS/MS檢測(cè)分析瓊脂糖珠所結(jié)合的蛋白；(2)Western blotting考察藥物或其他刺激因素作用后細(xì)胞內(nèi)蛋白水平變化；(3)CCK-8及SRB染色法評(píng)價(jià)藥物作用下的腫瘤細(xì)胞增殖能力；(4)PI單染、Annexin V-PE/7-AAD染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)以及DAPI染色法考察細(xì)胞凋亡；(5)中性彗星實(shí)驗(yàn)、抗53BP1免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DSBs損傷及修復(fù)情況；(6)建立人源性荷Hela宮頸癌裸小鼠模型和荷HCT116結(jié)腸癌裸小鼠模型,檢測(cè)藥物的體內(nèi)協(xié)同抗腫瘤作用；(7)TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)凋亡情況；(8)運(yùn)用siRNA技術(shù)沉默p21基因表達(dá)；(9)基因表達(dá)譜芯片分析相關(guān)差異基因的表達(dá)。結(jié)果：(1)吖啶黃的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)及對(duì)DNA-PK的抑制作用研究：構(gòu)建并驗(yàn)證了連接有吖啶黃的NHS活化瓊脂糖珠(ACF-NHS)用于分離吖啶黃結(jié)合蛋白(acriflavine-bound proteins)的實(shí)驗(yàn)體系,經(jīng)HPLC-MS/MS分析,綜合考慮吖啶黃在細(xì)胞內(nèi)的核漿分布,確定包括DNA-PKcs在內(nèi)的若干核蛋白為吖啶黃靶點(diǎn)蛋白；計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接、體外酶活性及細(xì)胞水平上的放射線/熱刺激造模實(shí)驗(yàn)證實(shí)吖啶黃能夠直接結(jié)合于DNA-PKcs的激酶區(qū)域,進(jìn)而抑制其激酶活性。(2)吖啶黃與美法侖協(xié)同抗腫瘤作用的研究：烷化劑美法侖能夠引起DNA-PKcs活性增加,抑制DNA-PKcs活性能夠增強(qiáng)美法侖作用；吖啶黃與美法侖聯(lián)合用藥能顯著增加后者抑制細(xì)胞增殖的作用,增加caspase依賴的細(xì)胞凋亡,相比于同時(shí)給藥,吖啶黃與美法侖的序貫給藥具有更強(qiáng)的協(xié)同效果；機(jī)制上,吖啶黃能夠逆轉(zhuǎn)美法侖單用所引起的DNA-PKcs激活,從而抑制NHEJ修復(fù),明顯累積DNA雙鏈斷裂(DSBs),進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡；這一作用與吖啶黃其他潛在靶點(diǎn)無關(guān)；在荷Hela宮頸癌裸鼠模型以及荷HCT116結(jié)腸癌裸鼠模型中吖啶黃與美法侖表現(xiàn)出良好的體內(nèi)協(xié)同抗腫瘤作用。(3)p53影響吖啶黃協(xié)同美法侖抗腫瘤作用的研究：GSEA分析顯示,吖啶黃與美法侖合用顯著影響p53信號(hào)通路；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)p53功能或表達(dá)缺失將干擾兩藥協(xié)同抗腫瘤作用；吖啶黃與美法侖聯(lián)合用藥后會(huì)上調(diào)p53下游凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)促進(jìn)調(diào)控細(xì)胞周期的p21基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá),p21通過抑制CDK2磷酸化進(jìn)而逆轉(zhuǎn)美法侖單用所誘導(dǎo)的S期阻滯；敲除p21可使吖啶黃與美法侖協(xié)同抗腫瘤作用減弱。結(jié)論：吖啶黃是一類具有良好臨床應(yīng)用前景的DNA-PK激酶抑制劑,體外抑制活性優(yōu)于現(xiàn)有DNA-PK抑制劑NU7026。吖啶黃能夠抑制DNA-PK介導(dǎo)的NHEJ修復(fù),從而增強(qiáng)美法侖誘導(dǎo)的DSBs及細(xì)胞凋亡；其合用效果的增加依賴于p53的表達(dá)及功能完整性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2451459