【摘要】：煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase, Nampt),是一個(gè)具有多種生物學(xué)功能的蛋白,與腫瘤、糖尿病、腦卒中等疾病相關(guān)。Nampt最重要的功能是催化哺乳動(dòng)物體內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)的生物合成,控制和調(diào)節(jié)細(xì)胞及線粒體內(nèi)的NAD總量。NAD是生物體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)的輔酶,作為質(zhì)子的傳遞者,參與細(xì)胞的能量代謝,NAD的生物能量狀態(tài)甚至決定了細(xì)胞的生死存亡。因此,Nampt作為NAD代謝通路中的限速酶,已成為各種相關(guān)疾病的藥物發(fā)現(xiàn)的重要靶標(biāo)。 本課題組前期研究證明,Nampt具有內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用,可作為腦卒中防治新靶標(biāo),開發(fā)Nampt激活劑將成為非常有前景的抗腦卒中新藥。與此同時(shí),在抗腫瘤藥物的研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞的Nampt酶活性升高,對(duì)Nampt抑制劑更為敏感,Nampt抑制劑通過抑制Nampt酶活性使得NAD耗竭,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。目前,已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的Nampt抑制劑由于生物利用度低、劑量限制性毒性等原因,未能觀察到較好的抗腫瘤療效。因此,為了發(fā)現(xiàn)首個(gè)Nampt激活劑,填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白；也為了發(fā)現(xiàn)更多療效好、結(jié)構(gòu)類型多樣的Nampt抑制劑,我們利用課題組前期建立的高通量篩選平臺(tái),對(duì)大樣本量的化合物庫開展了以Nampt為靶標(biāo)的篩選工作。此外,有研究報(bào)道,盡管缺少分泌所必須的信號(hào)序列,Nampt仍可以被肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌到細(xì)胞外,而對(duì)于Nampt在細(xì)胞外環(huán)境中是如何發(fā)揮其作用的一直存在很多爭(zhēng)議。為了進(jìn)一步探究Nampt是否具有細(xì)胞外酶活性,我們利用篩選平臺(tái)檢測(cè)方法,對(duì)血漿等生物樣品中Nampt進(jìn)行了檢測(cè)。 首先,我們對(duì)來自國(guó)家小分子化合物資源中心和Chemdiv化合物庫總計(jì)39234個(gè)化合物(492塊樣品板)在20μM濃度下進(jìn)行初篩,選出酶相對(duì)活性在40%以下的化合物347個(gè),酶相對(duì)活性在125%以上的化合物2042個(gè)。其次,在20μM濃度下,設(shè)置化合物對(duì)照組,對(duì)初篩選出的2389個(gè)化合物進(jìn)行復(fù)篩,以排除假陽性結(jié)果。經(jīng)復(fù)篩確認(rèn)后,選出695個(gè)Nampt活性化合物。再次,我們對(duì)其中的286個(gè)抑制型化合物,在2μM、0.2μM、0.02μM濃度下測(cè)定酶的相對(duì)活性,選出在2μM濃度下酶相對(duì)活性在50%以下并且有量效關(guān)系的化合物65個(gè),分別測(cè)定了這65個(gè)化合物對(duì)離體酶活性抑制50%的濃度,即IC50值,選到IC50值在100nM以下的化合物8個(gè),它們分別是4、22、23、24、36、39、44、60號(hào)化合物,它們的IC50值分別為59.41nM、85.52nM、70.94nM、75.86nM、62.65nM、86.92nM、85.05nM、60.85nM。篩選實(shí)驗(yàn)中的三個(gè)質(zhì)控參數(shù)—Z'因子、變異系數(shù)、信噪比均符合高通量篩選的要求。 為了進(jìn)一步確認(rèn)化合物的功能,我們考察了以上8個(gè)化合物在人肝癌細(xì)胞株HepG2上的細(xì)胞活性。設(shè)置化合物濃度為2μM,分別孵育HepG2肝癌細(xì)胞48小時(shí),CCK8法進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定。結(jié)果顯示,44號(hào)化合物對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制作用,抑制率為46%；之后,我們又進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞抑制活性的IC50值為1.73±0.29μM,說明該Nampt抑制劑具有較強(qiáng)抗腫瘤活性。此化合物是通過抑制Nampt的酶活性,導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)NAD耗竭,從而產(chǎn)生抗腫瘤活性。 為了進(jìn)行活性化合物的構(gòu)效關(guān)系分析,為先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供指導(dǎo),我們?cè)贑hemdiv化合物庫中分別尋找了先前發(fā)現(xiàn)的IC50小于2μM的47個(gè)活性化合物的結(jié)構(gòu)類似物,總計(jì)455個(gè),通過再次復(fù)篩的方法確認(rèn)這些結(jié)構(gòu)類似物的活性。結(jié)果顯示,絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)類似物無活性,或活性較差(IC5020μM);少數(shù)(12個(gè))結(jié)構(gòu)類似物的離體酶活性IC50值雖然在2μM-20μM之間,但活性不如先前發(fā)現(xiàn)的47個(gè)活性化合物。這些重復(fù)測(cè)定進(jìn)一步支持高通量篩選的可靠性。 此外,為了確認(rèn)Nampt是否具有細(xì)胞外酶活性,我們利用篩選中酶活性的檢測(cè)方法對(duì)血漿等生物樣品中的Nampt相關(guān)的分子進(jìn)行檢測(cè)。我們檢測(cè)了正常小鼠血漿中Nampt的直接催化產(chǎn)物—煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)是否存在,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得NMN的濃度為120±22.4nM；我們考察了ATP濃度對(duì)Nampt酶活性的影響,測(cè)得ATP濃度從10nM-107nM范圍內(nèi)酶活性的相對(duì)高低,結(jié)果顯示,在ATP濃度僅有10nM的條件下,Nampt仍具有較低的酶活性；我們制備了小鼠的大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型以檢測(cè)病理狀態(tài)下血漿ATP和Nampt水平,結(jié)果顯示,與假手術(shù)相比,MCAO模型組小鼠血漿ATP和Nampt酶水平都顯著升高。以上實(shí)驗(yàn)說明,Nampt在細(xì)胞外環(huán)境中具有煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性。 本課題首次采用高通量篩選的方法對(duì)大型化合物庫開展以Nampt為靶標(biāo)的篩選工作,通過離體酶活性水平的通量化篩選發(fā)現(xiàn)了多種新型結(jié)構(gòu)的Nampt抑制劑,有8個(gè)抑制活性較好,其中44號(hào)化合物在細(xì)胞水平也表現(xiàn)出較好的活性,并通過初步的結(jié)構(gòu)類似物活性分析,為后續(xù)研究這些小分子化合物與Nampt的分子作用模式奠定基礎(chǔ)。另外,我們利用篩選平臺(tái)的檢測(cè)方法,對(duì)血漿等生物樣品中Nampt的酶活性進(jìn)行了檢測(cè),確認(rèn)Nampt具有細(xì)胞外活性,為后續(xù)的臨床樣本檢測(cè)及作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96;R914

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本文編號(hào)：2430531