【摘要】：血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)是由28個(gè)氨基酸組成的直鏈陽(yáng)離子神經(jīng)肽,在體內(nèi)廣泛分布并發(fā)揮多種重要的生物作用。VIP作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的保護(hù)作用,這種作用與VIP強(qiáng)大的抗炎、抗氧化及抗凋亡功能有關(guān)。已經(jīng)證實(shí),VIP與多種神經(jīng)發(fā)育性和神經(jīng)炎癥疾病如唐氏綜合癥、胎兒酒精綜合癥、多發(fā)性硬化、帕金森病和阿爾茲海默病等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),肝素與VIP的相互作用可能在VIP的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制中扮演重要角色,VIP可促進(jìn)腦肥大細(xì)胞分泌多種神經(jīng)保護(hù)性物質(zhì)如神經(jīng)生長(zhǎng)因子和肝素等,肥大細(xì)胞分泌的肝素可以使VIP與其受體失偶聯(lián),增加細(xì)胞內(nèi)的c-AMP濃度而介導(dǎo)VIP的細(xì)胞內(nèi)作用。本研究以VIP體外抗菌活性為指標(biāo),初步探索了肝素寡糖與VIP的相互作用,并構(gòu)建了表達(dá)VIP的大腸桿菌菌株,表達(dá)純化出純度超過(guò)95%的VIP及15N-VIP,為研究肝素寡糖對(duì)VIP結(jié)構(gòu)的影響奠定了基礎(chǔ)。 1內(nèi)含肽介導(dǎo)的VIP及15N-VIP表達(dá)純化 采用內(nèi)含肽介導(dǎo)的幾丁質(zhì)標(biāo)簽親和純化(IMPACT)系統(tǒng)來(lái)制備VIP及’5N標(biāo)記的VIP (15N-VIP)。其策略是將目的蛋白和內(nèi)含肽(intein)及幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)融合表達(dá),由CBD介導(dǎo)使融合蛋白和幾丁質(zhì)樹(shù)脂親和結(jié)合,由具有可誘導(dǎo)自剪切活性的蛋白剪接元件—intein介導(dǎo),使目的蛋白與親和標(biāo)簽分離。本實(shí)驗(yàn)選用的表達(dá)載體為pTWINl,將插入片段連接在載體的SapⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)間,構(gòu)建表達(dá)融合蛋白CBD-Ssp Dnab Intein-VIP的重組載體pTWIN1-VIP,通過(guò)溫度和緩沖液pH的改變誘導(dǎo)intein的自切割活性。 首先根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性設(shè)計(jì)編碼VIP28個(gè)氨基酸的cDNA序列,并在其3’和5’端分別加入Sap Ⅰ酶切位點(diǎn)和終止密碼子、Pst I酶切位點(diǎn)。將所設(shè)計(jì)的序列插入PUC57載體,人工合成重組載體PUC57-VIP。以重組載體PUC57-VIP為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因,然后用限制性?xún)?nèi)切酶SapⅠ和PstⅠ切割PCR產(chǎn)物作為待插入片段。以相同的限制性?xún)?nèi)切酶酶切表達(dá)載體pTWIN1,再用T4DNA連接酶將插入片段和線(xiàn)性載體連接,測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建重組載體pTWIN1-VIP。將重組載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌ER2566,成功構(gòu)建表達(dá)融合蛋白CBD-Ssp Dnab Intein-VIP的工程菌。 與未誘導(dǎo)組相比,工程菌表達(dá)大小約30kD的蛋白,進(jìn)一步說(shuō)明重組載體構(gòu)建正確。 IPTG濃度的影響：首先考察了IPTG濃度對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響,發(fā)現(xiàn)IPTG濃度對(duì)表達(dá)量的影響很小,0.3mM時(shí)表達(dá)量稍有提高。 誘導(dǎo)溫度的影響：誘導(dǎo)溫度對(duì)融合蛋白的表達(dá)量及結(jié)構(gòu)形成至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)考察了15℃、25℃和30℃誘導(dǎo)時(shí)融合蛋白的表達(dá)量及被誘導(dǎo)切割的效率。電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)溫度越低,上清可溶性表達(dá)的融合蛋白比例越大,且15℃和25℃誘導(dǎo)時(shí)融合蛋白沒(méi)有發(fā)生胞內(nèi)切割；30℃誘導(dǎo)時(shí),上清可溶性表達(dá)的融合蛋白比例降低,且約有77%被胞內(nèi)切割。誘導(dǎo)溫度為15℃和25℃時(shí)融合蛋白不能被切割,而誘導(dǎo)溫度為30℃時(shí),融合蛋白的在柱切割效率約為68%。故最終確定的誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.3mM IPTG、30℃誘導(dǎo)3h。 切割緩沖液pH值的影響：考察了pH為5.0至7.0的切割緩沖液對(duì)融合蛋白切割效率的影響,結(jié)果表明,pH6.0時(shí)切割效率最高。 使用微型透析柱對(duì)目的肽洗脫液進(jìn)行脫鹽,再用MWCO分別為10kD和2kD的超濾管超濾脫鹽后的樣品,進(jìn)一步除去大小約為30kD和小于2kD的雜質(zhì)。最終可從1L發(fā)酵液中獲得270.8μg純度大于95%的VIP, LC-IT-TOF質(zhì)譜檢測(cè)的VIP分子量(3323.82Da)與理論值一致。 用構(gòu)建的表達(dá)CBD-Ssp Dnab Intein-VIP的大腸桿菌菌株在15N-M9培養(yǎng)基中表達(dá)’5N標(biāo)記的融合蛋白。誘導(dǎo)溫度為15℃、25℃和30℃時(shí)發(fā)現(xiàn),融合蛋白都發(fā)生了不同程度的胞內(nèi)切割,且30℃時(shí)融合蛋白的比例相對(duì)最高,在柱切割效率約為56%。對(duì)目的肽洗脫液脫鹽及超濾后,可從1L發(fā)酵液中獲得100.5μg純度大于95%的15N-VIP。LC-IT-TOF質(zhì)譜檢測(cè)純化的15N-VIP分子量(3366.76Da)與理論值一致。 2肝素寡糖的制備及分離純化 使用肝素酶Ⅰ在優(yōu)化的條件下對(duì)肝素鈉進(jìn)行酶解。100mg肝素鈉溶解后加入40μL肝素酶Ⅰ溶液,35℃水浴反應(yīng)6h。使用Bio gel P10凝膠層析柱,以0.2M NH4HCO3溶液為流動(dòng)相,以0.16mL/min的流速對(duì)各肝素寡糖組分進(jìn)行分離。使用PD MidiTrap G-10柱對(duì)分離的各肝素寡糖進(jìn)行脫鹽。負(fù)離子電子轟擊質(zhì)譜(ESI-MS)結(jié)果表明,所分離純化的各肝素寡糖分子量與理論值相符。 3肝素寡糖抑制VIP抗菌活性的研究 徑向擴(kuò)散法(radical diffusion assay, RDA)是檢測(cè)分子抗菌活性的靈敏有效的方法。本實(shí)驗(yàn)選擇C. albicans作為受試菌,用RDA法檢測(cè)肝素寡糖對(duì)VIP抗菌活性的影響。本實(shí)驗(yàn)考察了等摩爾的各肝素寡糖對(duì)C. albicans的作用,與VIP(500μg/mL)等摩爾的各肝素寡糖對(duì)其抗菌活性的影響及不同摩爾數(shù)的肝素八糖對(duì)VIP (500μg/mL)抗菌活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RDA法可靈敏地檢測(cè)VIP的抗菌活性及抗菌活性的變化。對(duì)抑菌圈直徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后表明：(1)各肝素寡糖對(duì)C. albicans無(wú)抗菌作用；(2)除dp2和dp4外,其他各肝素寡糖可明顯抑制VIP的抗菌活性,且dp8的作用最明顯：(3)隨著dp8與VIP摩爾比的降低,dp8對(duì)VIP抗菌活性的抑制作用減弱,在dp8與VIP的摩爾比降到約1：6時(shí)達(dá)到平臺(tái)期,無(wú)可見(jiàn)的抑制作用。 綜上所述,本論文確證了肝素寡糖可以與VIP相互作用,且作用區(qū)域?yàn)閂IP的抗菌活性結(jié)構(gòu)域,肝素八糖為最短的有效結(jié)合片段。成功構(gòu)建了VIP在大腸桿菌中的重組表達(dá)體系。肝素與VIP的相互作用在VIP的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制中扮演重要角色。本課題對(duì)深入研究肝素寡糖與VIP在分子水平上的相互作用,進(jìn)而探索VIP發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的內(nèi)在機(jī)制提供了良好的前期基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2401295