【摘要】：第一部分二甲雙胍對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元GABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控 目的：二甲雙胍(metformin)是一種安全有效的口服降糖藥物,廣泛用于治療2型糖尿病。近年研究表明,二甲雙胍促進(jìn)海馬新生神經(jīng)元生長,并改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶。而大量研究發(fā)現(xiàn),γ-氨基丁酸(y-aminobutyric acid, GAB A)能神經(jīng)傳遞在神經(jīng)元分化、樹突棘生長以及突觸形成過程中起到至關(guān)重要的作用。鑒于神經(jīng)再生與GABA能神經(jīng)傳遞的密切關(guān)系,我們推測GABA能神經(jīng)傳遞可能參與二甲雙胍誘導(dǎo)的神經(jīng)元再生,而GABAA受體的膜轉(zhuǎn)運(yùn)是影響抑制性突觸傳遞的關(guān)鍵因素之一。因此,本實(shí)驗(yàn)研究二甲雙胍對海馬神經(jīng)元GABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 方法：采用細(xì)胞免疫熒光,蛋白交聯(lián)的western blotting技術(shù)研究二甲雙胍對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元GABAA受體的膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究二甲雙胍對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元GABA能突觸傳遞的影響。 結(jié)果：(1)二甲雙胍促進(jìn)原代海馬神經(jīng)元y2subunit-containing GABAA受體膜表達(dá)(190.30±12.67%of control, n=12, p0.01vs control)。(2) western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對γ2亞基-containing GABAA受體總蛋白表達(dá)無影響,但促進(jìn)其膜表達(dá)(134.4±10.0%of control, n=5, p0.05vs control)。(3)二甲雙胍增加海馬神經(jīng)元微小抑制性突觸后電流(miniature inhibitory postsynaptic currents, mIPSCs)的幅度(193.9±20.0%of control, n=10,p＜0.01vs control)和頻率(115.6±5.0%of control, n=10,p＜0.05vs control)。 結(jié)論：二甲雙胍增加原代海馬神經(jīng)元抑制性突觸后受體GABAA受體的膜表達(dá),并增強(qiáng)該受體介導(dǎo)的抑制性突觸后電流。 第二部分二甲雙胍促進(jìn)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元GABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制 目的：研究表明,GABA受體相關(guān)蛋白(GABA receptor-associated protein, GABARAP)通過與GABAA受體的γ2亞基相互作用,介導(dǎo)GABAA受體的轉(zhuǎn)運(yùn)。同時,GABARAP屬于自噬相關(guān)基因8(autophagy-related protein8,Atg8)家族成員,在自噬發(fā)生過程中扮演重要角色,而Atg8家族成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是依賴叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型(forkhead box O3a, FoxO3a)的。另有大量證據(jù)表明,能量平衡調(diào)節(jié)關(guān)鍵激酶—腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine5'-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)激活FoxO3a,促使其進(jìn)入細(xì)胞核,增加其轉(zhuǎn)錄活性。已知二甲雙胍是經(jīng)典的AMPK激動藥,參與能量平衡的調(diào)節(jié)。由此,我們推測二甲雙胍可能通過激活A(yù)MPK-FoxO3a信號通路,促進(jìn)GABARAP的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)GABARAP與GABAA受體的γ2亞基相互作用,從而增強(qiáng)海馬神經(jīng)元GABA能神經(jīng)傳遞。因此,本實(shí)驗(yàn)探討AMPK-FoxO3a-GABARAP信號通路在二甲雙胍介導(dǎo)的(ABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。 方法：采用免疫共沉淀檢測二甲雙胍對海馬神經(jīng)元GABARAP與GABAA受體的Y2亞基的相互作用；采用實(shí)時熒光定量PCR及western blotting檢測二甲雙胍對海馬神經(jīng)元GABARAP及FoxO3a mRNA和蛋白水平的影響。采用蛋白交聯(lián)法,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、慢病毒沉默技術(shù)檢測下調(diào)FoxO3a表達(dá)對二甲雙胍誘導(dǎo)的GABARAP表達(dá)增加及GABAA受體膜表達(dá)的影響；采用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測FoxO3a與GABARAP啟動子的相互作用；采用藥理學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)下調(diào)AMPK表達(dá)后,檢測二甲雙胍對GABARAP表達(dá)和GABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；免疫熒光檢測二甲雙胍對海馬神經(jīng)元FoxO3a細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 結(jié)果：(1)二甲雙胍增加GABARAP表達(dá)(134.84±21.27%of control, n=5,p＜0.05vs control),并促進(jìn)其與GABAA受體Y2亞基的相互作用(154.21±13.87%of control, n=3,p＜0.05vs control),從而促進(jìn)GABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)。(2) FoxO3a參與二甲雙胍誘導(dǎo)的GABARAP表達(dá)增加及GABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)。(3) AMPK參與二甲雙胍誘導(dǎo)的FoxO3a的轉(zhuǎn)錄激活及GABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)。 結(jié)論：AMPK-FoxO3a-GABARAP信號通路介導(dǎo)二甲雙胍促進(jìn)海馬神經(jīng)元GABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。 第三部分二甲雙胍快速拮抗大鼠焦慮樣行為及其機(jī)制 目的：體外實(shí)驗(yàn)表明二甲雙胍促進(jìn)培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元GABAA受體膜表達(dá)。那么,二甲雙胍是否能夠通過同樣的機(jī)制促進(jìn)與焦慮相關(guān)腦區(qū)GABAA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)呢?此外,增強(qiáng)GABAA受體介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞能夠起到很好的抗焦慮功能,根據(jù)這一特點(diǎn),我們推測二甲雙胍可能具有抗焦慮作用。因此,本實(shí)驗(yàn)探討二甲雙胍對焦慮樣行為的影響。 方法：采用組織免疫熒光及蛋白交聯(lián)法檢測二甲雙胍對成年SD大鼠海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元GABAA受體膜表達(dá)的影響；采用曠場實(shí)驗(yàn)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測二甲雙胍對SD大鼠焦慮樣行為以及自發(fā)活動的影響；采用western blotting技術(shù)檢測二甲雙胍對海馬CA1區(qū)AMPK-FoxO3a-GABARAP信號通路的激活情況；采用免疫共沉淀檢測二甲雙胍對SD大鼠CA1區(qū)GABAA受體的γ2亞基與GABARAP的相互作用；采用曠場實(shí)驗(yàn)檢測特異性小肽TAT-GABARAP能否阻斷二甲雙胍誘導(dǎo)的抗焦慮樣行為；采用血糖試紙法檢測二甲雙胍對血糖的影響。 結(jié)果：(1)二甲雙胍促進(jìn)成年SD大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元GABAA受體膜表達(dá)(130.02±7.19%of control,n=5,p＜0.01vs saline-treated)。(2)通過曠場實(shí)驗(yàn)(224.81±35.04%of saline-treated,n=12, p0.01vs saline-treated)及高架十字迷宮(163.82±18.47%of saline-treated, n=12,p＜0.01vs saline-treated)實(shí)驗(yàn)證實(shí)二甲雙胍具有抗焦慮樣行為的功能,且不產(chǎn)生耐受。(3)急性給予二甲雙胍促進(jìn)海馬CA1區(qū)AMPK-FoxO3a-GABARAP信號通路的激活,增強(qiáng)GABAA受體γ2亞基與GABARAP的相互作用。(4)TAT-GABARAP能夠阻斷二甲雙胍誘導(dǎo)的快速抗焦慮樣行為。(5)二甲雙胍在抗焦慮作用時不影響自發(fā)活動及基礎(chǔ)血糖水平。 結(jié)論：二甲雙胍具有快速抗焦慮樣行為的作用,該作用與激活大鼠海馬CA1區(qū)AMPK-FoxO3a-GABARAP信號通路的激活相關(guān),阻斷該腦區(qū)GABAA受體的γ2亞基與GABARAP的相互作用可以取消二甲雙胍快速抗焦慮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2373896