【摘要】：B類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)屬于GPCR家族中的分泌素家族,包括15種不同類(lèi)型的受體,其在體內(nèi)的天然配體為多肽類(lèi)激素。B類(lèi)家族GPCR在體內(nèi)發(fā)揮重要生物學(xué)功能,其功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致肥胖癥、癌癥、神經(jīng)性退化病、骨類(lèi)疾病和心血管疾病等眾多疾病的發(fā)生,因此它們也是臨床治療的重要靶標(biāo)受體。雖然越來(lái)越多的科研人員投入到對(duì)該類(lèi)GPCR的結(jié)構(gòu)與功能研究當(dāng)中,但是對(duì)該類(lèi)家族全長(zhǎng)受體結(jié)構(gòu)尤其是激活態(tài)結(jié)構(gòu)及受體激活機(jī)制的研究進(jìn)展仍然相對(duì)緩慢,嚴(yán)重制約了人們對(duì)該家族如何與多肽相互作用以及如何激活下游信號(hào)通路的理解。本論文將主要通過(guò)以下四章的內(nèi)容闡明我們對(duì)該重大科研問(wèn)題的新見(jiàn)解。在第一章引言中,我們概述了目前B類(lèi)GPCR結(jié)構(gòu)及生化研究現(xiàn)狀,同時(shí)也闡述了該工作的亮點(diǎn)及解決的主要科學(xué)問(wèn)題。在論文第二章中,我們從具體B類(lèi)GPCR入手,以胰高血糖素樣肽I受體(GLP-1R)為研究對(duì)象,從功能學(xué)角度闡述GLP-1R的ECD在受體激活過(guò)程中發(fā)揮的作用及具體機(jī)制。通過(guò)運(yùn)用全長(zhǎng)受體突變、串聯(lián)多肽、截短多肽和共表達(dá)等方法,我們發(fā)現(xiàn)分開(kāi)表達(dá)的GLP-1R的ECD和TMD在全長(zhǎng)多肽的激活下會(huì)發(fā)生直接相互作用,并介導(dǎo)下游信號(hào)通路激活。進(jìn)一步通過(guò)突變實(shí)驗(yàn),證實(shí)了ECD與TMD的作用界面位于EC1(第一胞外環(huán)),EC2和EC3上。該發(fā)現(xiàn)顛覆了對(duì)傳統(tǒng)B類(lèi)GPCR“兩域”激活模型的認(rèn)識(shí),提出B類(lèi)GPCR的ECD和TMD在多肽激活過(guò)程中并非相對(duì)獨(dú)立,而具有直接相互作用的新機(jī)制,因此該研究引起了對(duì)于B類(lèi)GPCR激活時(shí)ECD與TMD如何相互作用及構(gòu)象如何變化等一系列問(wèn)題的大討論。在論文第三章中,我們以同屬B類(lèi)GPCR的胰高血糖素受體(GCGR)為研究對(duì)象,結(jié)合結(jié)構(gòu)模型與突變實(shí)驗(yàn),探討了B類(lèi)GPCR在激活態(tài)與非激活態(tài)之間轉(zhuǎn)變的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),GCGR上位于TM5(第五跨膜段)、TM6以及連接兩者的IC3(第三胞內(nèi)環(huán))上彼此相對(duì)的四個(gè)氨基酸(L329,L333,,M338和F345)形成一個(gè)疏水口袋,該口袋對(duì)維持TM6乃至整個(gè)受體的非活性構(gòu)象至關(guān)重要,分別突變?cè)搮^(qū)域的四個(gè)氨基酸,特別是突變位于TM6的F345和位于IC3的M338,單點(diǎn)突變即導(dǎo)致受體的非活性狀態(tài)解除,產(chǎn)生較強(qiáng)的非依賴于多肽的自我激活效應(yīng)。但是我們發(fā)現(xiàn)該激活機(jī)制只適用于GCGR。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),位于TM6的T351、TM2的H177、TM3的E245和TM7的Y400形成一個(gè)非常保守的極性中心口袋(T351與Y400之間形成氫鍵,E245與H177之間形成氫鍵),破壞該極性口袋中的氫鍵作用會(huì)導(dǎo)致GCGR發(fā)生自我激活效應(yīng)�；谏鲜鼋Y(jié)果,我們提出了GCGR激活的機(jī)制模型,即TM6被疏水區(qū)域和保守極性口袋固定在非活性構(gòu)象,突變破壞這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域會(huì)導(dǎo)致TM6向遠(yuǎn)離中心區(qū)域移動(dòng)而處于激活構(gòu)象。該極性口袋的重組在其他B類(lèi)GPCR,如甲狀旁腺激素受體(PTH1R)、血管活性腸肽I受體(VIP1R)、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽受體I(PAC1R)和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體(CRF1R)等中普遍存在。這一B類(lèi)GPCR激活的通用機(jī)制拓展了我們對(duì)于B類(lèi)GPCR激活與未激活機(jī)制的理解,同時(shí)也為未來(lái)開(kāi)發(fā)靶向這些受體的藥物奠定了基礎(chǔ)。在論文第四章中,我們以甲狀旁腺激素受體(PTH1R)為研究對(duì)象,試圖探索該藥物靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu),希望能從晶體學(xué)角度回答關(guān)于B類(lèi)GPCR激活機(jī)制的問(wèn)題。由于全長(zhǎng)PTH1R蛋白性質(zhì)及表達(dá)量都無(wú)法滿足結(jié)晶要求,因此我們首先從PTH1R跨膜段入手。為了得到被多肽激活的跨膜段受體結(jié)構(gòu),我們創(chuàng)新性的將PTH多肽串聯(lián)在跨膜段受體的N端,并通過(guò)引入二硫鍵,篩選新型去垢劑等方法,使其處于穩(wěn)定的激活構(gòu)象。進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化表達(dá)質(zhì)粒、純化條件和結(jié)晶條件等等一系列優(yōu)化改造,獲得了表達(dá)性狀良好,且維持受體激活態(tài)的融合蛋白及一些有希望的小晶體類(lèi)似物,為進(jìn)一步結(jié)晶以及靶向PTH1R的骨質(zhì)疏松癥小分子藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：2369790